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斑痣盘菌科的物种多样性和齿裂菌属等的RAPD分子标记

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1文献综述

2引言

3斑痣盘菌科的分类

3.1材料和方法

3.1.1研究材料和实验仪器

3.1.2标本整理

3.1.3形态结构特征显微检查

3.2有关属的属征

3.2.1皮下盘菌属

3.2.2散斑壳属

3.2.3齿裂菌属

3.2.4湿皮盘菌属

3.3分种检索表

3.4种的描述

3.4.1杉生皮下盘菌

3.4.2短尖头齿裂菌

3.4.3多角齿裂菌

3.4.4清风藤散斑壳

3.4.5尖齿裂菌

3.4.6栗齿裂菌

3.4.7络石散斑壳

3.4.8硬湿皮盘菌

4斑痣盘菌科部分种的培养性状

4.1材料与方法

4.1.1试验材料

4.1.2实验方法

4.2斑痣盘科一些种的培养性状

4.3悬钩子皮下盘菌的几个生物(培养)型

5齿裂菌属与皮下盘菌属的RAPD分析

5.1材料和方法

5.1.1菌株及其来源

5.1.2菌丝的培养

5.1.3试剂配制及仪器设备

5.1.4 DNA的提取及质量检测

5.1.5 RAPD-PCR扩增条件的优化

5.1.6随机引物的筛选及RAPD扩增

5.1.7 RAPD扩增产物处理

5.2数据处理

5.3 RAPD反应结果

5.3.1皮下盘菌和齿裂菌的部分RAPD电泳图

5.3.2 RAPD扩增结果

5.4皮下盘菌属和齿裂菌属聚类结果和种内及种间的亲缘关系

5.4.1皮下盘菌属种内及近似种间RAPD分析

5.4.2齿裂菌属种内及近似种间RAPD分析

6结论

7讨论

7.1斑痣盘菌科分类中存在的问题

7.2 RAPD技术在生物分类中的优点及局限性

参考文献

图版

致谢

作者简介

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摘要

本文以世界较先进的分类系统为原则，从形态解剖、个体发育、生态习性、地理分布等表型性状方面对斑痣盘菌科中一些种进行较系统的分类研究。共查明隶属于齿裂菌属(Coccomyces)、皮下盘菌属(Hypoderma)、散斑壳属(Lophodermium)、湿皮盘菌属(Hypohelion)4属的8个种，其中包括4个新种，即栗齿裂菌(Coccomycescastaneae)、杉生皮下盘菌(Hypoderma cunninghamiicola)、清风藤散斑壳(Lophodermium sabiae)、络石散斑壳(L．trachelosperi)；并且对4个国内已知种进行了补充研究，追加了这些种的新寄主和地理新分布。 以组织分离法对采自天堂寨国家森林公园的斑痣盘菌活材料进行分离培养，共获得隶属于齿裂菌属和皮下盘菌属的17号分离株，接菌于MA培养基上，定期观察、记载各菌株的菌落形状、大小、色泽、结构、气生菌丝和潜生菌丝状况、生长速度、分泌色素与否以及是否产生分生孢子等特征。对悬钩子皮下盘菌(Hypoderma rubi)各菌株，以培养性状为依据，对其进行种下阶元分类，共划分出8个生物(培养)型。 分别对21个皮下盘菌属(Hypoderma)分离株和12个齿裂菌属(Coccomyces)菌株进行了DNA提取，RAPD-PCR扩增体系的优化，并对提取的DNA进行RAPD-PCR扩增反应。因RAPD技术的稳定性和重复性相对较差，所以有必要寻找一个适合本试验的RAPD-PCR反应体系，以提高其稳定性与重复性。笔者从引物用量、模板用量、Mg<'2+>用量、dNTPs用量、Taq酶用量、退火温度及时间、延伸时间、循环次数等方面对齿裂菌属和皮下盘菌属两属的RAPD反应体系进行了优化，得到结果是：25μl反应体系中，ddH<,2>O 16.3μl，10×Buffer 2.5μl，Mg<'2+>(25mmol/L)2μl，dNTPs(10mmol/L)2μl，引物(12.5μmol/L)1μl，Taq酶(5 U/μl)0.2μl，模板(100ng/μl)1μl。扩增程序为：95℃预变性5min，50次循环；94℃变性60s，36℃退火100s，72℃延伸140s；最后一次循环后在72℃延伸10 min。 筛选出14个随机引物，使用优化的RAPD-PCR反应参数及程序对齿裂菌属12个菌株的DNA进行扩增，共扩增出140个位点，其中多态性位点数为133个，占总数的95％。扩增位点最多的是引物S11，有20个位点数；$404引物次之；扩增位点数最少的则是引物S7和S220，只有3个位点数。扩增出的片断长度大多在250-2000bp之间。采用UPGMA方法构建聚类树状图，通过表型性状分类和RAPD分析结果比较，二者能较好地统一起来。 按优化的RAPD-PCR反应体系对皮下盘菌21个菌株的DNA进行扩增，14个随机引物共扩增出132个位点，其中多态性位点数为120个，占总数的91％。扩增位点最多的是引物S130，有17个位点数；引物S298和S33为次；扩增位点数最少的是引物S7，仅有4个位点数。扩增片断长度也是位于250-2000bp之间。使用UPGMA法构建聚类树状图，在遗传距离4.10处，21个菌株被分成7类，该结果与菌株形态解剖学特征、寄主范围、采集地基本一致。

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