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新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及分离株HN蛋白抗原表位差异性分析

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综述:新城疫病毒HN蛋白抗原表位研究进展

1新城疫病毒HN蛋白概述

2新城疫病毒HN蛋白抗原位点研究进展

3单克隆抗体在NDV研究中的应用

3.1在病毒抗原差异性研究上的应用

3.2在临床诊断上的应用

3.3在流行病学研究中的应用

参考文献

第一章新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备

1材料

1.1毒株、鸡胚及鸡抗NDV多抗血清

1.2细胞系、实验动物及表达NDV蛋白的重组鸡痘病毒

1.3菌种、质粒与细胞

1.4主要试剂

1.5溶液的配制

1.6主要仪器及耗材

1.7分子生物学软件

2方法

2.1全病毒及核酸免疫原的制备

2.2单抗的制备

3结果

3.1 PCR产物鉴定

3.2 pGEM-T-HN酶切鉴定结果

3.3 pcDNA-HN酶切鉴定结果

3.4间接免疫荧光结果

3.5杂交瘤细胞株的建立

3.6单抗腹水效价测定

3.7单抗亚类鉴定

3.8单抗与囊膜蛋白的反应性

4讨论

参考文献

第二章单抗在病毒抗原差异上的应用

1材料

1.1病毒、阳性血清与单抗

1.2主要试剂

1.3主要仪器设备

2方法

2.1单抗腹水的纯化

2.2酶标单抗的制备与纯化

2.3单抗在HN蛋白上的分区

2.4 NDV毒株单抗排谱实验

3结果

3.1辛酸-硫酸铵法提纯单抗的SDS-PAGE结果

3.2酶标单抗的直接ELISA效价的测定

3.3单抗在HN蛋白上的分区结果

3.4单抗排谱结果

4讨论

参考文献

致谢

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摘要

新城疫(Newcastle Disease,ND)是由副粘病毒科、禽腮腺炎病毒属中的新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的多种禽类发生感染和死亡的一种急性、接触性传染病。从1920年代到现在,NDV已经在世界范围内引起了四次大的流行,给养禽业造成了巨大的经济损失。新城疫病毒粒子囊膜表面包含两种类型的糖蛋白:血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase protein,HN)和融合蛋白(fusion protein,F)。HN蛋白与病毒的毒力及致病性密切相关,是主要的保护性抗原,在NDV的研究中具有非常重要的意义。尽管NDV只有一个血清型,但不同亚型的病毒间存在较大的抗原差异。单克隆抗体具有针对单个抗原决定簇的特异性,可以识别不同的抗原位点,因此可以用来检测不同毒株之间抗原的差异性。   本文分别用全病毒和真核表达质粒作为免疫原,免疫小鼠后制备了针对HN蛋白不同抗原表位的单抗,然后用单抗对不同时间、不同来源、不同基因型的NDV毒株进行排谱反应,进而分析了不同NDV毒株HN蛋白间的抗原差异。   ⑴全病毒免疫原的纯化以及核酸免疫原的构建。JS/05/5/Go毒株接种10日龄SPF鸡胚,37℃孵化以扩增病毒,鸡胚死亡后收集尿囊液,离心纯化后作为免疫原;同时,已有的研究证实HN蛋白的大多数功能位点主要位于球状区,其中包含6个反向平行的β折叠,大部分抗原位点主要位于前400个氨基酸残基,即β1~β3折叠上。因此,根据前3个β折叠在空间上的位置,我们将编码前400位氨基酸的基因序列分为两段,分别连接到真核表达载体pcDNA3.1(-)上,构建了重组表达质粒:pcDNA-HN1和pcDNA-HN2。重组质粒转染真核表达细胞后,能够与抗NDV的多抗反应,证明蛋白成功表达并具有活性。   ⑵HN蛋白不同抗原表位单抗的研制。将纯化好的病毒和构建好的表达质粒分别免疫BALB/C小鼠后,取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。用间接ELISA方法筛选阳性克隆,并采用有限稀释法对其进行亚克隆。以病毒作为免疫原,共筛得10株杂交瘤细胞系,分别为:1B5,1C5,2G7,2G8,3B5,4C11,4H6,5C2,5G8,5G9;以两段核酸为免疫原各筛选出1株杂交瘤细胞系,分别为4H11,2E8。单抗与NDV主要蛋白的作用结果显示:上述单抗均针对病毒的HN蛋白。单抗的研制为新城疫病毒HN蛋白抗原差异性的研究打下了基础。   ⑶单抗在病毒抗原差异性研究上的应用。将本研究获得的和实验室冻存的共15株针对HN蛋白的杂交瘤细胞系用辣根过氧化物酶标记后进行竞争ELISA试验,结果显示:15株杂交瘤细胞系分属于10个不同的抗原位点。选取10株代表性的单抗对实验室不同来源、不同时间、不同基因型的30株NDV进行排谱实验,结果显示,其中4株单抗针对的位点比较保守,另外6株单抗所针对的抗原位点在部分毒株中发生了变异。根据单抗与病毒的反应性,可将30株病毒分为6组,每组病毒具有不同的单抗反应谱。单抗与病毒之间的反应差异性表明HN蛋白上的部分抗原表位存在着较明显的变异。

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