来自嗜热子囊菌的耐热重组木聚糖酶在巴斯德毕赤酵母中的异源表达

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目的：通过在巴斯德毕赤酵母中异源表达进一步提高嗜热子囊菌木聚糖酶的热稳定性。
　　方法：基于巴斯德毕赤酵母的密码子使用偏倚优化原嗜热子囊菌木聚糖酶基因xynA的基因序列。构建重组质粒 pGAPZαA-xynA、pPIC9K-xynA，经线性化处理后电击转化入表达宿主毕赤酵母 GS115中，构建重组菌株。经过含博莱霉素（zeocin）的YPD琼脂板初筛后，抽提基因组筛选阳性转化子。使用博来霉素浓度梯度YPD琼脂平板复筛转化子。采用硫酸铵沉淀、有机溶剂沉淀、离子交换柱层析、分子筛层析等方法分离、纯化重组木聚糖酶。通过SDS-PAGE凝胶电泳和酶谱实验确定重组木聚糖酶大小，利用高碘酸硝酸银染色和Endo H酶处理检测重组酶是否为糖蛋白及糖蛋白的类型。以失活的重组木聚糖酶 XynA作对照，与重组木聚糖酶XynA同样在Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中42°C处理激光打印纸72h，检测其脱墨效果。在Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中高温（70~80°C）酶解未处理的玉米芯，温育36h后测定其糖化效果。
　　结果：密码子优化后的 xynA基因通过设计、合成，并且在巴斯德毕赤酵母中表达。筛选出在木聚糖琼脂板中形成最大水解透明圈的菌株RX8，用于摇瓶发酵，并产生40U/ml的木聚糖酶活性。S-75型葡聚糖凝胶层析纯化后的重组木聚糖酶比酶活最高，达到1053U/mg的木聚糖活性。通过SDS-PAGE凝胶电泳和酶谱实验确定重组木聚糖酶大小为75kDa。高碘酸-硝酸银染色法显示该重组木聚糖酶为糖蛋白，其表观分子量显著高于其蛋白理论值，表明该重组木聚糖酶在表达的过程中发生了高度糖基化。重组木聚糖酶 XynA的最适反应条件为75°C和pH8.0。该酶在100°C下保温8h仍保持高于80%的酶活性。重组木聚糖酶在Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中42°C处理激光打印纸72h的脱墨效果（247%）高于报道的芽孢杆菌木聚糖酶CKBx1D（200％）。其在高温酶解过程（70~80°C）中对未处理的玉米芯保温36h后的糖化效率7.44%。此外，该重组木聚糖酶在较宽的 pH（4.0~10.0）范围内具有较好的酸碱耐受性和稳定性。
　　结论：重组木聚糖酶XynA首次在毕赤酵母中实现了异源表达，其重组木聚糖酶的耐热性较原始木聚糖酶得到较大提高。较高的比酶活力和良好的热稳定性使该重组木聚糖酶具有较大的工业化应用潜力及经济价值，也为其它耐热木聚糖酶的研究奠定了理论基础。

著录项

作者
韩瑞祥;
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作者单位

安徽医科大学;

展开▼
授予单位安徽医科大学;
学科遗传学
授予学位硕士
导师姓名丁锐;
年度 2017
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类微生物遗传学;基因的表达;
关键词
木聚糖酶; 热稳定性; 异源表达; 巴斯德毕赤酵母;

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