抗Siglec-9抗体Fab段抑制脂多糖诱导的炎性反应的体外研究

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研究目的:Siglec-9属于免疫球蛋白超家族的成员，归属于CD33相关的Siglec，通过识别含有唾液酸的糖链结构，在细胞增殖、活化以及凋亡和自噬方面发挥重要作用，同时参与调控机体的固有免疫和适应性免疫。Siglec-9主要表达于免疫细胞，如中性粒细胞和单核细胞，在淋巴细胞和树突状细胞上也可表达。脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征，细菌内毒素刺激巨噬细胞产生大量的炎性因子，引起机体的抗炎因子和促炎因子失衡，严重时导致脓毒性休克和多器官功能衰竭。本课题主要是通过基因工程技术，制备、表达抗Siglec-9Fab段，并对其进行生物特性鉴定，通过体外活性实验进一步探讨该抗体在炎症方面发挥的作用。
　　研究方法:
　　1.制备抗Siglec-9抗体Fab利用前期筛选得到的阳性噬菌体，通过PCR技术扩增抗体轻链可变区（VL）和重链可变区（VH），经测序得到核酸和氨基酸序列并与数据库比对。根据核酸序列设计引物，通过重叠延伸PCR技术将抗体轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH1)分别与轻链可变区和重链可变区连接，获得重组轻链（L）和重链（Fd）。经过限制性核酸内切酶酶切，L和Fd与表达载体pETDUET-1连接，构建重组质粒pETDUET-1-Fab。将重组质粒pETDUET-1-Fab转入大肠杆菌BL21，加入IPTG诱导表达，经蛋白纯化系统得到抗Siglec-9抗体Fab段。
　　2.抗 Siglc-9抗体 Fab段与抗原结合能力的鉴定和抗体亲和力分析采用SDS-PAGE和 Western blot鉴定抗 Siglec-9抗体 Fab段，ELISA、流式细胞仪和Biacore X100分别检测抗Siglec-9抗体Fab与Siglec-9的特异性结合能力和抗体的亲和力。
　　3.抗Siglec-9抗体Fab的体外实验抗Siglec-9抗体Fab作用于THP-1细胞分化的巨噬细胞和人单核外周血单核细胞来源的巨噬细胞，通过Q-PCR和ELISA分别检测炎性细胞因子的表达量，通过Western blot检测TLR4信号通路上蛋白磷酸化水平的变化。
　　研究结果：
　　1.通过 PCR技术成功扩增抗体可变区，经测序验证未产生无功能基因或发生基因突变，利用重叠延伸PCR技术连接抗体的可变区和恒定区，得到重组重链Fd和轻链L，重组原核系统表达质粒pETDUET-1-Fab成功构建。转入大肠杆菌BL21表达，经蛋白纯化系统纯化得到抗Siglec-9抗体Fab。
　　2.SDS-PAGE和Western blot结果显示抗Siglec-9抗体Fab主要表达于上清中，分子量约27KD。ELISA、流式细胞仪结果显示抗 Siglec-9抗体 Fab特异性结合Siglec-9。Biacore X100检测得亲和常数为6.58×10-7。
　　3.Q-PCR和ELISA显示抗Siglec-9抗体Fab可有效的抑制促炎性细胞因子和促进抑炎性细胞因子的表达量，Western blot显示抗Siglec-9抗体Fab可抑制TLR4信号通路上蛋白的磷酸化水平。
　　研究结论：
　　本实验研究成功制备抗Siglec-9抗体Fab段，该抗体特异性结合Siglec-9，并具有较高的亲和力，体外实验研究表明可明显抑制促炎性细胞因子IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-6和促进抗炎性细胞因子IL-10的mRNA水平和蛋白水平表达量，并且可抑制TLR4信号通路上蛋白的磷酸化，发挥抗炎保护作用。本研究通过基因工程得到的单克隆抗体，可能成为新的预防和治疗炎性相关疾病的方法。

著录项

作者
褚萨萨;
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作者单位

安徽医科大学;

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授予单位安徽医科大学;
学科内科学(传染病)
授予学位硕士
导师姓名汪茂荣;
年度 2017
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类医学免疫学;
关键词
基因工程; 脂多糖诱导; 炎性反应; 体外活性;

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