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缺氧预处理对颅脑外伤大鼠内质网应激蛋白P-eIF2α、GADD34表达影响的实验研究

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第一部分 缺氧预处理对颅脑外伤大鼠皮层ERS-蛋白P-eIF2α表达及神经元凋亡影响的实验研究

1 材料与方法

1.1 动物与实验分组

1.2 主要仪器设备

1.3主要试剂

1.4 动物模型制备及取材

1.5 取材

1.6 光镜观察

1.7 电镜观察神经元细胞受损情况

1.8 Western Blotting检测P-eIF2α蛋白的表达变化

1.9 免疫组织化学法检测皮层脑组织中P-eIF2α蛋白的表达

1.10 TUNEL免疫组化染色检测神经元凋亡情况

1.11 统计学分析

2 结 果

2.1 动物造模情况

2.2 HE染色观察各组大鼠脑组织改变

2.3 电子显微镜观察神经元细胞超微结构改变

2.4 Western Blotting检测P-eIF2α蛋白的表达结果

2.5 免疫组化染色P-eIF2α蛋白表达

2.6 TUNEL染色检测神经元细胞凋亡情况

3 讨 论

3.1 缺氧预处理对颅脑外伤大鼠病理改变的影响

3.2 内质网应激及P-eIF2α

3.3 缺氧预处理对颅脑外伤后P-eIF2α表达变化的影响

3.4 TUNEL染色观察神经元凋亡及缺氧预处理对其变化的影响。

4 结论

第二部分 缺氧预处理对颅脑外伤大鼠海马GADD34表达及行为学影响的实验研究

1 材料与方法

1.1 实验动物

1.2主要仪器

1.3主要实验试剂(部分试剂同本课题第一部分)

1.5实验动物模型制作

1.6各组大鼠伤后行为学评估

1.7标本取材

1.8 RT-PCR检查GADD34mRNA表达变化

1.9 Western Blotting检测GADD34蛋白表达

2 结 果

2.1 造模结果

2.2 行为学评估结果

2.3 RT-PCR检测GADD34 mRNA表达

2.4 Western Blotting检测GADD34蛋白表达

2.5 免疫组化染色观察GADD34表达

2.6 神经元凋亡情况

3 讨 论

4 结 论

全文总结

参考文献

附录

致谢

综 述：内质网应激与颅脑外伤

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摘要

课题背景：
　　战争即有伤亡，颅脑外伤（Traumatic Brain Injury，TBI）是士兵众多战伤类型中的主要损伤形式之一，甚者是致死的重要原因，具有表现形式多样、病情发展迅速、死亡率高、预后差异性大等众多特点。现已逐渐成为各大军事及地方医学院、研究所等机构研究的重要领域。随着科学技术水平的不断发展和进步，交通工具尤其是汽车的使用率逐渐增加，使得TBI的发生率逐年上升。因无法干预颅脑外伤相关直接作用力的情况下，寻找能最大程度降低外伤后脑组织继发性损害的方法，如炎性应激、氧化应激及内质网应激等，为临床中提高颅脑外伤患者的救治率、降低死亡率以及最大程度降低伤残率等方面，都有着重要的意义。缺氧预处理（Hypoxic preconditioning，HPC）是指通过提前给予一定程度适当的低氧训练，可以显著的增强机体各组织，尤其是脑组织对于随后突发的各种缺血、缺氧等打击的耐受能力，提高自身的防护，从而发挥重要的神经保护，抗缺血、缺氧等造成的应激损伤能力。磷酸化的真核翻译起始因子2α(Phosphorylated eukaryotic translation initiation factor2 alpha，P-eIF2α)在内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）时由eIF2α发生磷酸化产生，磷酸化后导致内质网中蛋白质合成受到阻碍。当ERS持续发生时，P-eIF2α持续生成，导致正常功能的蛋白质合成严重受阻，然而可以选择性的合成细胞凋亡基因，最终导致细胞走向凋亡或坏死。生长停滞与DNA损害可诱导蛋白34（Growth arrest and DNA damage-inducible protein34，GADD34）是内质网应激过程中的重要分子，参与内质网中蛋白质合成受阻后的再启动。研究缺氧预处理对颅脑外伤中内质网应激及其相关凋亡的变化规律，可促进改善颅脑外伤后神经元损伤、凋亡及行为认知功能，为临床工作中提高对TBI的救治提供有利的基础理论支持。
　　第一部分缺氧预处理对颅脑外伤大鼠皮层内质网应激蛋白P-eIF2α表达及神经元凋亡影响的实验研究
　　目的：
　　（1）观察颅脑外伤后大鼠脑组织病理改变及缺氧预处理对其改变的影响；
　　（2）探讨缺氧预处理对颅脑外伤大鼠皮层脑组织内质网应激蛋白P-eIF2α表达变化及神经元凋亡的影响。
　　方法：
　　208只成年雄性SD大鼠采用随机数字表法分为以下4个实验组：对照（Con）组、缺氧预处理（HPC）组、外伤（TBI）组、缺氧预处理颅脑外伤（HPCT）组。TBI组与HPCT组进一步分为：1h、3h、6h、12h和24h、3d、7d、14d时间点共8个亚组。Con组仅进行头皮切开及缝合处理，随后处死。采用改良的Feeney’s法自由落体脑损伤打击方法制作颅脑外伤大鼠动物模型。打击点定位于：前囟门后3.0mm，且中线左侧旁开3.0mm处，骨窗直径约5.0mm；打击重量及高度：50g砝码，垂直高度为25cm处自由落下撞击骨窗，打击深度约3-4mm。缺氧预处理模型是在颅脑外伤打击前在低压氧仓内预先给予适当的缺氧训练（-50.47 KPa，3h/d，连续3d）。采用HE染色法和制作新鲜脑组织标本超薄切片，分别在光镜和电镜下观察各组大鼠脑组织大体结构和神经元细胞超微结构改变；免疫组化法和Western Blotting法检测挫伤部位周围皮层脑组织中P-eIF2α蛋白的表达变化，以及TUNEL染色法检测神经元凋亡变化情况。
　　结果：
　　（1）Con组和HPC组光镜和电镜下观察发现脑组织大体及微观结构无明显改变， HPCT组较TBI组大鼠脑组织光镜下改变明显减轻，电镜下神经元细胞超微结构受损减轻，完整性保持较好，内质网结构受损减轻。
　　（2）免疫组化染色及Western Botting法检测发现，P-eIF2α蛋白在颅脑外伤后3h表达开始增加，伤后6h-12h时间段表达呈上升趋势，在伤后24h达到高峰，随后在3d-14d逐渐下降；其中，伤后6h-7d时间段P-eIF2α蛋白表达HPCT组较TBI组显著下降，两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。TUNEL染色观察神经元凋亡情况发现，伤后6h TBI组和HPCT组凋亡细胞逐渐开始表达，伤后12h-24h凋亡细胞数逐渐增加，伤后3d达高峰，随后在伤后7d-14d逐渐恢复。其中，HPCT组较TBI组在伤后12h-7d时间凋亡细胞数明显下降，凋亡率显著降低，两组比较差异具有显著性意义（P＜0.05）。
　　结论：
　　（1）缺氧预处理可显著降低大鼠颅脑外伤后脑组织病理改变，较好的维持神经元细胞超微结构的完整性，减轻内质网损伤。
　　（2）缺氧预处理可通过选择性抑制颅脑外伤大鼠皮层内质网应激蛋白P-eIF2α的表达，减轻ERS引起的损伤，降低神经元细胞凋亡，继而促进细胞存活并维持神经元功能的稳定。
　　第二部分缺氧预处理对颅脑外伤大鼠海马GADD34表达及行为学影响的实验研究
　　目的：
　　探讨缺氧预处理对颅脑外伤大鼠海马GADD34表达及行为学变化的影响，研究缺氧预处理参与减低颅脑外伤后内质网应激损伤的机制。
　　方法：
　　清洁新西兰SD雄性大鼠共48只，使用随机数字表法分为对照（Con）组，缺氧预处理（HPC）组，颅脑外伤（TBI）组，缺氧预处理颅脑外伤（HPCT）组。大鼠颅脑外伤模型采用改良的自由落体装置制作，预先将大鼠在低压氧仓(-50.47 kPa)内训练3小时/天、连续3天来制作缺氧预处理动物模型。四组大鼠均在伤后24h处死并留取相应标本。采用改良Sugrwara法对大鼠伤后24h行为学进行评估；采用RT-PCR、蛋白免疫印迹（Western Blotting）法以及免疫组化染色检测颅脑外伤大鼠海马组织中GADD34 mRNA和蛋白的表达变化，以及TUNEL染色观察神经元凋亡变化情况。
　　结果：
　　RT-PCR、蛋白免疫印迹和免疫组化染色发现，HPCT组大鼠海马组织中GADD34 mRNA及蛋白表达较TBI组显著增高,两组比较差异具有统计学意义（P<0.05）；而且，外伤后24h行为学评分HPCT组大鼠明显高于TBI组，两组进行比较差异具有统计学意义（P<0.05）；TUNEL染色还发现HPCT组较TBI组凋亡细胞数明显减少，凋亡率显著降低，两组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：
　　缺氧预处理可降低颅脑外伤大鼠海马行为学损伤，其机制可能是通过上调海马GADD34的表达，降低海马神经元凋亡，减轻ERS损伤从而发挥脑保护作用。

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