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基于Ion Torrent平台测序数据的微生物全基因组序列组装及分析方法

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第一章 基于Ion Torrent平台测序数据的微生物全基因组序列组装

1. Ion Torrent平台简介

2.全基因组组装算法和组装软件的选择

3.微生物全基因组组装辅助工具

4.讨论

第二章 用实时定量PCR解决微生物基因组序列组装中重复序列问题

1. 引言

2. 材料与方法

3. 结果

4. 讨论

第三章 微生物基因组分析方法

1. COG注释

2.不同菌株同源基因含量比较

3. 细菌毒力因子的查找

4. 讨论

结论

参考文献

综述： 重复序列在高通量测序组装中的影响及解决方法

附录

个人简历

致谢

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摘要

微生物个体微小（直径小于0.1毫米），构造简单，包括细菌、放线菌、原生动物、藻类和原虫等，与人类日常生活、健康密切相关。微基因组作为遗传信息的携带者，是我们破译微生物生物学性状的核心密码。进行微生物基因组研究，对于了解微生物遗传机制、代谢过程以及一些微生物特殊功能如耐药性、致病性的遗传基础具有重要意义。作为微生物基因组学研究的基础，获得微生物全基因组序列显得重中之重。
　　随着高通量测序技术的突飞猛进，测序通量大大提高，测序时间和成本不断降低，微生物全基因组测序也在飞速发展。然而，高通量测序的短读长又给全序的组装带来了新的困难。当前主流的高通量测序平台有三种：罗氏454公司的GS FLX+、Illumina公司的Hiseq及Miseq、Life公司的Ion Torrent。其中Ion Torrent高通量测序平台具有测序速度最快，操作简单、灵活和低成本等优点，是中等规模测序最佳选择，非常适合微生物这类小基因组的全基因组测序。
　　本文以Ion Torrent平台测序数据为基础，全面探索了微生物全基因序列的组装过程以及遇到问题，并提出了相应的解决方法。全基因组序列组装类似于搭积木、玩魔方，简而言之，就是将零散的测序片段还原成完整的基因组序列的过程。基于Ion Torrent平台测序数据的特点，我们在组装算法和组装软件进行了选择，选择了基于OLC算法罗氏454公司推出的商业组装软件Newbler。而后在进行后续的基因组完成图时，我们又针对微生物基因组组装特点，选取了三种基因组组装辅助工具。其中ContigScape用来展示微生物基因组组装过程中由重复序列造成的 contig之间的复杂关系，使得我们可以快速熟悉基因组结构的基本信息；基因组光学图谱用于指导序列组装，显著增加微生物基因组序列拼装质量，并对组装结果矫正分析；GapFiller用于补基因组内部的gap。综合以上的方法，我们建立了基于Ion Torrent平台测序数据微生物全基因组序列组装方法，其中也编写了很多个性化的程序用于简化流程，希望对没有基因组组装经验的科研人员有所帮助。
　　此外，针对基因组序列组装中的重复序列问题，我们还建立的实时定量 PCR法，通过简单的设计引物，PCR扩增，观察CT值就可以直接判断出contig位置关系，更省时间、精力，更重要的是节约成本，对二代测序数据组装，尤其是微生物基因组序列组装，有很大的意义。最后，我们也以COG注释、不同菌株基因含量比较、毒力基因的查找为例，简要的介绍了微生物基因组个性化的后续分析方法。
　　综上，本文在现有方法基础上，利用Ion Torren测序平台数据，进一步完善了微生物基因组序列组装流程，提出了更加简单、快捷的方法来解决组装过程中遇到的重复序列问题，也对全基因组序列进行了一些后续分析，简化了分析流程。文中提到的方法，均有实例对应。然而，针对不同的研究对象和要求，研究者仍需要具体问题具体分析。希望本文能够给其他科研人员以参考。

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