含LfcinB基因慢病毒载体的构建及体外对SKOV3细胞的作用的研究

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目的：构建并鉴定牛乳铁蛋白肽基因LfcinB基因的慢病毒载体,研究外源LfcinB基因转染人卵巢癌细胞SKOV3的细胞生长增殖抑制和凋亡诱导作用,探索治疗卵巢癌的新方法。方法：根据Genbank报道的LfcinB基因序列,合成LfcinB基因,PCR方法扩增LfcinB基因,与经Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后的pLJM1载体含CMV启动子和绿色荧光蛋白(GFP)连接、转化,产生pLJM1-LfcinB慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定用pLJM1-LfcinB载体、Δ8.91载体、pVSVG载体三质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞中绿色荧光蛋白GFP的表达水平测定病毒滴度;Western-blot检测LfcinB的表达;体外培养人卵巢癌细胞SKOV3,重组载体转染细胞后,MTT法观察对SKOV3细胞的生长抑制作用,流式细胞仪分析LfcinB对SKOV3细胞周期和凋亡的影响,Honest33258染色观察细胞凋亡形态;根据文献报道的 OSP-1启动子序列,合成OSP-1基因,插入pLJM1-LfcinB载体,构建携带OSP-1特异启动子的重组载体。结果：PCR和测序证实成功构建了pLJM1-LfcinB慢病毒载体;浓缩病毒悬液滴度为2×108TU/ML;Western-blot检测到目的肽成功表。pLJM1-LfcinB对体外培养的人卵巢癌细胞系SKOV3的生长有抑制作(P＜0.05),荧光显微镜观察到凋亡细胞典型的形态学特征,流式细胞仪检测到细胞凋亡的变化;成功构建了携带有OSP-1特异启动子的重组载体。结论：在体外,pLJM1-LfcinB对体外培养的人卵巢癌细胞系SKOV3的生长有抑制作用,并可诱导其凋亡,成功构建OSP-1-LfcinB基因重组载体,为进一步研究LfcinB靶向治疗卵巢癌奠定基础。

著录项

作者
张晓宇;
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作者单位

安徽医科大学;

展开▼
授予单位安徽医科大学;
学科生物化学与分子生物学
授予学位硕士
导师姓名秦宜德;
年度 2011
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类卵巢肿瘤;肿瘤治疗学;
关键词
卵巢癌; 牛乳铁蛋白肽基因; 慢病毒载体; SKOV3细胞;

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