枇杷叶三萜酸对慢性支气管炎防治作用的细胞分子机制研究

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目前对慢性支气管炎的治疗主要着眼于抗炎、镇咳、平喘作用的研究，至今尚无令人十分满意的药物。而对于改善机体免疫功能状态的免疫调节药物，尤其是具有免疫调节作用的中药的研究还没有引起足够的重视。本课题组前期在国家自然科学基金的资助下(NO：30371766)证实楷杷叶的有效活性部位为三萜酸。枇杷叶三萜酸(TAL)具有明显的抗炎及免疫调节作用，对慢支具有防治作用。鉴于慢性支气管炎免疫功能紊乱的病理机制和枇杷叶三萜酸(TAL)高效、低毒的作用特征，基于AM在慢支发病中的重要作用，本实验以肺泡巨噬细胞(AM)为研究靶点，探讨TAL对慢性支气管炎防治作用的细胞分子机制，为将其开发为治疗慢支的新药提供试验依据。前期研究表明TAL灌胃给药可明显降低慢支大鼠肺组织匀浆中TNF-α、IL-8水平，升高IL-10的表达，并对慢支大鼠气道粘膜上皮细胞NF-kB、ICAM-1的蛋白表达具有一定的抑制作用。TAL能明显抑制慢支大鼠AM自由基的产生[5]；抑制炎症介质PGE2及LTB4的合成及释放[6]；抑制AM中iNOS的表达及NO的合成；此外通过抑制NF-kB表达及活化，降低AM中TNF-α、IL-1的表达和分泌[7]。TAL既能抑制AM细胞因子(TNF-α、IL-8、IL-1)炎症介质(PGE2、LTB4)的表达又明显抑制AM自由基、iNOS的合成。但AM是如何被激活的以及炎性介质的生成与释放机制一即基因的转录和翻译是如何调控的目前还不明了。因此进一步研究AM等细胞激活的分子机制是CB发病机制研究的主要方向。鉴于MAPK信号传导通路在炎症反应中的重要作用，本课题旨在前期研究的基础上，以AM为平台，MAPK信号通路为研究对象，研究慢支大鼠AM MAPK信号传导通路，探讨TAL对其信号传导通路的影响，研究TAL对慢支大鼠AM凋亡的影响，从而进一步阐明TAL对慢性支气管炎防治作用的细胞分子机制，为将其开发为治疗慢支的新药提供试验依据。课题为国家自然科学基金资助项目(NO：30572355)。研究内容主要包括以下三个方面： 1.慢支模型大鼠肺泡巨噬细胞细胞因子、炎症介质的MAPK信号通路研究MAPK三条通路的特异性阻制剂均能显著抑制慢支模型大鼠AM异常增加的IL-1、TNF-α活性，而JNK，ERK MAPK通路的特异性阻制剂Curcumin，PD98059能显著抑制慢支模型大鼠AM异常增加的PGE2活性(P<0.01)。JNK,ERK MAPK通路的特异性阻制剂可显著抑制CB大鼠AM内COX-2 mRNA及蛋白表达(P<0.01 or P<0.05)。p38 MAPK通路的特异性阻制剂SB203580体外给药可显著抑制CB大鼠AM内HO-1mRNA表达而p38，JNK MAPK通路的特异性阻制剂SB203580及Curcumin可显著抑制CB大鼠AM内HO-1蛋白表达(P<0.0lorP<0.05)。MAPK三条信号传导通路阻制剂体外给药均可显著抑制CB大鼠AM内TNF-α mRNA表达，而JNK，p38 MAPK通路的特异性阻制剂Curcumin，SB203580可显著抑制CB大鼠AM内TNF-α蛋白表达(P<0.05)。提示慢支大鼠AM中细胞因子、炎症介质(COX-2、TNF-α、HO-1、IL-1、PGE2)的表达及活性分别由不同的MAPK信号传导通路介导。MAPK信号传导通路可分别从转录水平及转录后水平对其表达进行调节。 2.慢支大鼠肺泡巨噬细胞内MAPK信号传导通路及TAL的作用环节研究分别应用MAPK通路上游信号蛋白(PTK、P13K、Akt、PKC)的特异性阻制剂预处理AM，观察下游蛋白磷酸化水平，以确定转录前调节相关信号蛋白。结果显示：Genistein可以不同程度的抑制PKC、P13K/Akt、MAPK通路磷酸化的程度；LY294002可以抑制P13K/Akt磷酸化的水平，同时诱导p-p38、p-JNK的高表达，对PKC/ERK这条经典途径的磷酸化也有一定的激活作用：CalphostinC阻断PKC的磷酸化，对P-ERK水平有较大影响，而对p-p38和p-JNK则影响不大。推出慢支模型大鼠AM中LPS信号转导MAPK通路可能为PTK-----P13K/Akt-----JNK/P38或者PTK-----P13K-----PKC-----ERK。进一步探讨了TAL对MAPK通路的转录前信号蛋白的作用环节。发现TAL对-p38，p-JNK，p-ERK，p-PKC，p-Akt皆有一定抑制作用(其中对p38和JNK磷酸化水平的抑滞效应最为显著)，而对p-P13K，其作用不甚明显，同时，TAL对模型组TLR4受体水平的增高也没有明显的降低作用。也就证明TAL，对MAPK调控可能发生在P13K下游某个环节，具体机制还有待研究。 3.TAL对慢支模型大鼠肺泡巨噬细胞凋亡的影响及其可能的作用机制研究与正常组比较，模型大鼠AM凋亡率明显降低(P<0.01)；与模型组比较，TAL给药组及ERK通路抑制剂PD98059组AM凋亡率显著升高(P<0.05 orP<0.01)。而JNK通路抑制剂Cureumin组AM凋亡率显著降低(P<0.05)。进一步研究显示，模型大鼠AM Bax表达降低而Bel-2表达升高(P<0.01)；TAL给药组可显著升高慢支大鼠AM Bcl-2表达而降低Bax表达(P<0.05 0r P<0.01)。TAL抑制慢支大鼠AM胞浆内游离钙浓度升高，可使慢支大鼠AM激活数量减少。TAL能明显诱导AM的凋亡，降低AM的活性，使AM的数量减少，活性降低，从而发挥防治慢支的作用。MAPK通路参与细胞凋亡的调节，其中ERK通路可能抑制细胞凋亡而JNK通路发挥促凋亡的作用。TAL对慢支大鼠AM的促凋亡作用可能与其调节AM Bel-2/Bax的表达，调节慢支大鼠AM游离钙胞内分布及影响AMMAPK通路的活化有关。

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作者
黄艳;
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作者单位

安徽医科大学;

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授予单位安徽医科大学;
学科药理学
授予学位博士
导师姓名李俊;
年度 2008
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类实验药理学;
关键词
慢性支气管炎; 枇杷叶三萜酸; 防治作用;

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