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【6h】

弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HXGPRT）和腺苷激酶（AK）基因的克隆、表达及多抗血清的制备

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摘要

1.前言

2.材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3.实验结果

4.讨论

5.结论

6.参考文献

附录

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摘要

目的：克隆弓形虫RH株次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)和腺苷激酶(AK)基因，构建原核表达载体pET28a/HXGPRT和pET28a/AK，表达HXGPRT和AK重组蛋白，利用此重组蛋白免疫新西兰白兔制备多抗血清。 方法：复苏本室液氮保种的弓形虫RH株速殖子，腹腔接种BALB/c小鼠，转种3代，抽取腹水，收集、纯化弓形虫株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入BamHI和XhoI酶切位点。应用RT-PCR扩增弓形虫HXGPRT，AK基因片段，目的基因HXGPRT插入克隆载体pMD18-T，目的基因AK插入克隆载体pGEM-T，提取重组质粒，BamHI和XhoI双酶切获得目的基因，插入原核表达质粒pET28a中，重组子双酶切、PCR和测序鉴定，转化大肠杆菌E．coli BL21(DE3)并以IPTG诱导表达。亲和层析法纯化重组蛋白抗原，SDS-PAGE和Western blotting验证表达量和免疫活性，改良的Bradford(考马斯亮蓝)法测定纯化rHXGPRT和rAK蛋白浓度。免疫新西兰白，收集多抗血清，ELISA测定多抗滴度，Western blotting鉴定免疫活性。 结果：RT-PCR从弓形虫RH株RNA中扩增出693bp的HXGPRT和1092bp的AK目标基因片段。成功地将其克隆入pET28a。pET28a/HXGPRT和pET28a/AK经BamHI和XhoI双酶切，获得与目标基因大小相一致的基因片段，测序结果与GenBank比对HXGPRT同源性100％，AK同源性99.9％。含pET28a/HXGPRT和pET28a/AK的宿主菌E．coliBL21(DE3)经IPTG诱导后高效表达上述2个重组蛋白，经Ni<'2+>亲和层析法纯化获得了高纯度的rHXGPRT和rAK蛋白。SDS-PAGE检测其分子量：rHXGPRT为26.4kDa，rAK为38.357kDa，二者与各自预期分子量大小相符。Western blotting显示：rHXGPRT能够被弓形虫患者血清中的IgG抗体和Torch-ELISA试剂合中的Tox-IgG阳性控制血清识别，rAK能够被Torch试剂合中的Tox-IgG阳性控制血清识别，获得了两种纯化的具有特异免疫反应性的重组蛋白。rHXGPRT和rAK分别免疫新西兰白兔，获得ELISA滴度为1∶10<'7>和1∶10<'6>两种多价抗血清，Westernblotting显示，每种多价血清不仅能和其对应的重组蛋白而且和虫体内相应蛋白发生特异性免疫反应。 结论：成功地从弓形虫RH株基因组中获取了HXGPRT和AK基因，构建了pET28a/HXGPRT和pET28a/AK重组质粒，并获得了高效表达；重组蛋白免疫新西兰白兔获得了两种高效价多克隆抗体。本研究为对弓形虫嘌呤核酸代谢及基因沉默的研究，以及研发标准化弓形虫免疫血清诊断试剂打下了基础。

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