少孢节丛孢菌侵染性胞外丝氨酸蛋白酶的基因克隆、表达及其杀线虫活性研究

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家畜消化道线虫病是一类严重危害动物养殖业持续健康发展的寄生虫疾病,每年给我国畜牧业造成巨大的经济损失。目前,对家畜消化道线虫病的防治主要依靠化学驱虫药物,但长期使用易使虫体产生抗药性,降低药效;同时,动物性食品中的药物残留不但影响人类的身体健康还会对生态环境造成污染。为了克服化学药物防控带来的弊端,国内外相继开展了家畜线虫病生物防控研究,通过线虫的天敌—捕食线虫性真菌及其侵染线虫过程中分泌的毒力因子(胞外蛋白酶)来控制线虫病已经显示出巨大的应用潜力,被认为是一种人-动物-环境友好型线虫病生物防控方法。因此,分离捕食线虫性真菌、研究其侵染线虫的胞外蛋白酶对于家畜消化道线虫病的科学防控具有重要意义。　　本研究以具有强捕食线虫活性的少孢节丛孢菌新疆分离株XJ-XAo1为研究对象,克隆了其侵染性丝氨酸蛋白酶XAoz1、P12和P186的基因,进行了生物信息学分析;将丝氨酸蛋白酶XAoz1基因克隆入酵母表达载体中,在毕赤酵母系统诱导表达,对表达的重组蛋白酶开展了杀线虫活性分析。该研究揭示了少孢节丛孢菌XJ-XAo1株在侵染线虫过程中分泌的毒力因子XAoz1的基因结构特征,分析了重组蛋白酶reXAoz1酶学特性并测定了其杀线虫活性,为研制防控家畜消化道线虫病的新型蛋白酶喷洒生防制剂奠定了理论基础。研究方法和主要结果如下:　　1.少孢节丛孢菌胞外丝氨酸类蛋白酶的基因克隆及序列分析:以捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌新疆分离株XJ-XAo1为供试菌株,采用PCR方法成功克隆了XAoz1、P12和P186三个丝氨酸蛋白酶的DNA基因(GenBank登录号分别为JF747254、JX898768和JX898769),并对基因进行了生物信息学分析,与国内外捕食线虫性真菌分离株进行了序列同源性分析,构建了系统进化树。结果成功克隆了XAoz1(1344bp)、P12(1429bp)和P186(1468bp)的基因。XAoz1、P12各含1个内含子,P186有3个内含子,内含子均以GT开头,AG结尾;它们都含有丝氨酸蛋白酶催化中心三联体结构域—XAoz1:Asp164、His203、Ser353,P12:Asp193、His230、Ser383,P186:Asp160、His192、Ser345;以及2个与底物结合的S1区—XAoz1:Ser259Leu260Gly261和Ala285Ala286Gly287,P12:Ser289Leu290Gly291和Ala315Ala316Gly317,P186:Ser251Leu252Gly253和Ala277Ala278Gly279。另外,还具有潜在的糖基化位点。XAoz1与已报道PII、Aoz1同源性高(97.5％、98.3%),亲缘关系较近,提示XAoz1与PII、Aoz1可能是少孢节丛孢菌(A.oligospora)在不同环境条件下表达的同功酶或同源基因的类似物;P12、P186分别与PII、Aoz1亲缘关系较远,且XAoz1、P12、P186三者之间亲缘关系也较远。　　2.少孢节丛孢菌胞外丝氨酸蛋白酶XAoz1在毕赤酵母系统的表达:通过RT-PCR方法扩增了XAoz1成熟肽的cDNA基因,用酶切方法构建了重组表达质粒pPIC9K-XAoz1,线性化后电击转化表达宿主毕赤酵母GS115。结果经过PCR、表型及G418抗性筛选,成功获得具有G418抗性(1.0mg/mL)且表型为His+Mut+的阳性重组酵母转化子;阳性转化子经1.5%甲醇诱导培养72h,重组蛋白酶(reXAoz1)的酶活性达到最大(12168U/mg蛋白);SDS-PAGE和Western blot显示表达上清中有约50kDa的特异性条带;reXAoz1能降解酪蛋白、脱脂乳、BSA、明胶、变性胶原和线虫表皮等蛋白底物,提示reXAoz1具有酶活性。　　3.重组丝氨酸蛋白酶的纯化及杀线虫活性分析:重组毕赤酵母GS115/pPIC9k-XAoz1经过1.5%甲醇诱导培养72h后,其发酵液通过离心、超滤浓缩和His-Bind层析柱纯化步骤后,对分离获得的分析纯重组蛋白酶reXAoz1进行了杀线虫活性分析。结果表明,reXAoz1在50℃、pH6.5~9.5的条件下酶活性较高且稳定,pH8.5时达到最高峰;该重组酶作用的底物范围较宽,能降解酪蛋白、脱脂乳、BSA、明胶、变性胶原和线虫角皮等;reXAoz1对秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)分别作用12h、24h和36h后,对C.elegans的杀灭率为52%、85%、100%,对H.contortus的杀灭率为45%、70%、83%,提示reXAoz1能有效降解线虫体壁,破坏线虫组织结构进而杀灭线虫。

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作者
王俊伟;
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作者单位

石河子大学;

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授予单位石河子大学;
学科预防兽医学
授予学位硕士
导师姓名孟庆玲;
年度 2013
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种 chi
中图分类
关键词
家畜消化道线虫病,少孢节丛孢菌,侵染性丝氨酸蛋白酶,基因克隆,杀线虫活性,XAoz1基因;

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