宿主蛋白SYNCRIP和MCM3在猪细小病毒复制过程中作用及机制研究

声明

英文缩略词及中英文对照

第一章 宿主蛋白Syncrip和MCM在病毒复制过程中作用及机制研究进展

1.1 Syncrip 在宿主细胞 mRNA可变剪接和病毒复制过程中作用及机制

1.1.1 Syncrip在宿主细胞mRNA可变剪接过程中作用及机制

1.1.2 可变剪接在病毒复制过程中作用及机制

1.1.3 Syncrip在病毒复制过程中作用及机制

1.2 MCM在宿主细胞DNA复制和病毒复制过程中作用及机制

1.2.1 MCM在宿主细胞 DNA复制过程中作用及机制

1.2.2 MCM在病毒复制过程中作用及机制

第二章 细小病毒与宿主蛋白互作机制研究进展

2.1 细小病毒概述

2.2 细小病毒与宿主蛋白互作机制

2.2.1 细小病毒与宿主蛋白互作在病毒粘附和侵入过程中作用

2.2.2 细小病毒与宿主蛋白互作在病毒入核和复制过程中作用

2.2.3 细小病毒与宿主蛋白互作在病毒出核过程中作用

2.3 本研究的目的和意义

第三章 猪细小病毒非结构蛋白NS多克隆抗体制备

3.1 材料

3.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒

3.1.2 实验动物

3.1.3 主要试剂

3.1.4 主要仪器设备

3.2 方法

3.2.1 ns基因的生物信息学分析

3.2.2 重组质粒pET-32a-NS 构建和鉴定

3.2.3 NS重组蛋白的诱导表达

3.2.4 NS重组蛋白的诱导表达条件优化

3.2.5 NS重组蛋白的纯化

3.2.6 NS蛋白多克隆抗体制备

3.2.7 NS蛋白多克隆抗体效价检测

3.2.8 NS蛋白多克隆抗体的特异性检测

3.3 结果

3.3.1 ns基因的生物信息学分析

3.3.2 重组质粒pET-32a-NS 的构建和鉴定

3.3.3 NS重组蛋白的诱导表达检测

3.3.4 NS重组蛋白表达条件的优化

3.3.5 NS重组蛋白的纯化

3.3.6 鼠抗 NS血清抗体的效价测定

3.3.7 多克隆抗体的特异性检测

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 稳定携带遗传标记的猪细小病毒全长感染性克隆构建及其生物学特性研究

4.1 材料

4.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒

4.1.2 实验动物

4.1.3 主要试剂

4.1.4 主要仪器设备

4.2 方法

4.2.1 PPV的增殖及病毒滴度检测

4.2.2 pKQLL(F1+F2)质粒的构建

4.2.3 PPV全长感染性克隆质粒的构建

4.2.4 病毒拯救及鉴定

4.2.5 拯救病毒的遗传稳定性检测

4.2.6 拯救病毒的复制特性检测

4.2.7 拯救病毒诱导凋亡特性检测

4. 2. 8动物试验验证

4.2.9 统计学分析

4.3 结果

4.3.1 PPV病毒滴度的测定

4.3.2 PPV全长感染性克隆质粒的构建和鉴定

4.3.3 拯救病毒的鉴定

4.3.4 拯救病毒的遗传稳定性鉴定

4.3.5 拯救病毒的复制特性

4.3.6 拯救病毒诱导凋亡特性的鉴定

4.3.7 动物试验

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 猪细小病毒NS1-mRNA关键宿主互作蛋白筛选及鉴定

5.1 材料

5.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒

5.1.2 主要试剂

5.1.3 主要仪器设备

5.2 方法

5.2.1 NS1-mRNA的生物素化标记

5.2.2 NS1-mRNA关键宿主互作蛋白的筛选

5.2.3 syncrip基因的克隆、真核表达以及原核表达载体的构建

5.2.4 RNA-pulldown检测NS1-mRNA和 Syncrip的互作

5.2.5 RIP检测NS1-mRNA和 Syncrip的互作

5.2.6 荧光原位杂交（Fish）检测 NS1-mRNA和Syncrip的互作

5.2.7 EMSA检测 NS1-mRNA和Syncrip的互作

5.3 结果

5.3.1 NS1-mRNA关键宿主互作蛋白的筛选

5.3.3 RNA-pulldown鉴定NS1-mRNA和 Syncrip的互作

5.3.4 RIP鉴定NS1-mRNA和 Syncrip的互作

5.3.5 荧光原位杂交（Fish）鉴定 NS1-mRNA和Syncrip的互作

5.3.6 EMSA鉴定 NS1-mRNA和Syncrip的互作

5.4 讨论

5.5 小结

第六章 宿主蛋白Syncrip在猪细小病毒复制过程中作用及机制

6.1 材料

6.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒

6.1.2 实验动物

6.1.3 主要试剂

6.1.4 主要仪器设备

6.2 方法

6.2.1 干扰 syncrip基因的表达对PPV复制的影响

6.2.2 syncrip基因敲除细胞系的构建

6.2.3 syncrip基因敲除对PPV复制的影响

6.2.4 syncrip基因敲除对NS2表达的影响

6.2.5 PPVns2缺失型感染性克隆的构建及ns2缺失对PPV复制的影响

6.2.6 PPV对Syncrip表达的调控

6.2.7 检测Syncrip过表达对NS1表达的影响

6.2.8 ns2剪接位点突变载体的构建

6.2.9 检测Syncrip调控 NS1-mRNA表达的方式

6.2.10 数据分析

6.3 结果

6.3.1 干扰 syncrip基因的表达显著抑制PPV的复制

6.3.2 syncrip基因敲除细胞系的构建

6.3.3 syncrip基因敲除显著抑制PPV的复制

6.3.4 syncrip基因敲除显著抑制NS2的表达

6.3.5 PPVns2缺失型感染性克隆的鉴定

6.3.6 PPV的复制水平与Syncrip的表达水平呈正相关

6.3.7 Syncrip能够促进 NS1的剪切

6.3.8 ns2剪接位点突变载体的鉴定

6.3.9 Syncrip通过作用于ns1上ns2的 3’末端调控ns2剪接

6.4 讨论

6.5 小结

第七章 猪细小病毒VP2 关键宿主互作蛋白筛选及鉴定

7.1 材料

7.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒

7.1.2 主要试剂

7.1.3 主要仪器设备

7.2 方法

7.2.1 vp2基因的克隆、原核表达载体及真核表达载体的构建

7.2.2 VP2关键宿主互作蛋白的筛选

7.2.3 mcm3基因的克隆、原核表达载体与真核表达载体的构建

7.2.4 免疫共沉淀（Co-IP）检测 VP2和 MCM3的互作

7.2.5 间接免疫荧光检测VP2和 MCM3的互作

7.2.6 GST-pulldown和 His-pulldown检测 VP2和 MCM3的互作

7.3 结果

7.3.1 VP2原核表达载体和真核表达载体的鉴定

7.3.2 VP2关键宿主互作蛋白的筛选

7.3.3 MCM3原核表达载体与真核表达载体的鉴定

7.3.4 Co-IP鉴定 VP2和 MCM3互作

7.3.5 间接免疫荧光鉴定VP2和 MCM3互作

7.3.6 GST-pulldown和 His-pulldown鉴定 VP2和 MCM3的互作

7.4 讨论

7.5 小结

第八章 VP2 及其互作蛋白MCM3 在猪细小病毒复制过程中作用及机制

8.1 材料

8.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒

8.1.2 主要试剂

8.1.3 主要仪器设备

8.2方法

8.2.1 干扰vp2基因表达对PPV复制的影响

8.2.2 mcm3基因敲除细胞系的构建

8.2.3 mcm3基因敲除对PPV复制的影响

8.2.4 VP2截短体原核表达载体的构建

8.2.5 VP2和 MCM3互作结构域的检测

8.2.6 NS1真核表达载体的构建

8.2.7 检测 VP2/NS1/MCM3和PPV DNA互作

8.2.8 DNA-pulldown检测VP2、NS1、MCM3和PPV DNA的互作

8.2.9 NS1与 MCM3互作的检测

8.2.10 VP2与病毒DNA及 MCM3之间互作的检测

8.2.11 VP2与PPV基因组 DNA结合基序的检测

8.2.12 VP2结合基序突变型PPV的构建及对病毒复制的影响

8.2.13 数据分析

8.3 结果

8.3.1 干扰 vp2基因表达显著抑制PPV的复制

8.3.2 mcm3基因敲除显著抑制PPV的复制

8.3.3 VP2截短体原核表达载体的鉴定

8.3.4 VP2的115 aa~231 aa是其与宿主蛋白MCM3发生互作的关键结构域

8.3.5 NS1真核表达载体的鉴定

8.3.6 在PPV复制过程中VP2/NS1/MCM3与病毒 DNA存在互作

8.3.7 VP2和 NS1在PPV复制过程中与病毒 DNA存在直接互作

8.3.8 NS1不参与招募 MCM3到病毒基因组 DNA

8.3.10 VP2结合于PPV基因组DNA的 300 nt~356 nt 基序

8.3.11 突变PPV基因组DNA的 VP2结合基序完全阻止病毒 DNA的复制

8.4 讨论

8.5 小结

结论

创新点

参考文献

致谢

个人简历