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细菌内膜蛋白插入酶YidC的结构与功能研究

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摘要

第1章 引言

1.1 膜蛋白的晶体学研究

1.1.1 膜蛋白样品的获取

1.1.2 膜蛋白的结晶方法

1.1.3 X射线晶体学

1.2 革兰氏阴性细菌内膜上的蛋白质转运系统

1.2.1 SecYEG转运系统

1.2.2 Tat系统

1.2.3 YidC家族转运系统

1.3 本课题的选题背景和意义

第2章 YidC的晶体结构研究

2.1 本章引言

2.2 YidC的表达与纯化

2.2.1 本节引言

2.2.2 材料和方法

2.2.3 本节结果讨论

2.3 YidC的晶体筛选

2.3.1 本节引言

2.3.2 材料和方法

2.3.3 本节结果讨论

2.4 YidC的晶体优化

2.4.1 本节引言

2.4.2 材料和方法

2.4.3 本节结果讨论

2.5 TmYidCP1的晶体结构解析

2.5.1 本节引言

2.5.2 材料与方法

2.6 TmYidC晶体的数据收集和结构解析

2.6.1 数据收集与结构解析

2.6.2 TmYidC结构分析

2.7 本章讨论

2.8 本章附

第3章 基于晶体结构的YidC功能研究

3.1 本章引言

3.2 TM3-TM5界面作为YidC底物的出口

3.2.1 本节引言

3.2.2 材料与方法

3.2.3 本节结果讨论

3.3 α.螺旋束Ⅰ和Ⅱ在周质侧的运动性对于YidC的活性是必需要的

3.3.1 本节引言

3.3.2 材料和方法

3.3.3 本节结果讨论

3.4 P2 loop区域保守负电荷氨基酸的表型分析

3.4.1 本节引言

3.4.2 材料与方法

3.4.3 本节结果讨论

3.5 本章讨论

3.6 本章附

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果

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摘要

细胞中有超过三分之一的蛋白是膜蛋白,这些膜蛋白的生理功能角色非常广泛,包括ATP酶,各种离子通道以及通透酶等等。对于细胞来说,要将这么多的膜蛋白顺利地转运插入到磷脂双分子层将是一个非常关键和具有挑战性的生理活动。分布于细菌、叶绿体、线粒体中的YidC/Alb3/Oxal家族蛋白很早就被鉴定出具有催化膜蛋白插入磷脂双分子层的功能。细菌中的YidC除了可以独立地将一部分膜蛋白作为底物催化插入到磷脂双分子层,还可以辅助SecYEG转运蛋白。SecYEG是目前发现的最重要的膜转运通道,除了负责转运大部分分泌蛋白,它还负责催化大部分膜蛋插入到细胞膜,后一过程中,往往需要YidC的协同参与。目前关于YidC的具体功能机制,大部分还不清楚。许多以往的研究表明,新生膜蛋白特定区域的带电氨基酸的分布对于其对YidC的依赖性起着非常关键的作用。
  本论文中,我们解析了来自于Thermotoga maritima种属中的YidC(TmYidC)3.8(A)分辨率的晶体结构。TmYidC的C端五次跨膜螺旋相互作用在一起,形成一个亲水性的沟渠结构,这五个跨膜螺旋的周质侧半叶相互紧密地聚束在一起,形成沟渠的封口端,而胞质侧半叶则松散地相互作用在一起,形成沟渠的开口端。沟渠内存在的五个保守的极性氨基酸(Gln322、Arg260、Ser371、Thr374和Asn413)使得跨膜区具有明显的亲水性。另外,我们单独解析了TmYidC周质侧第一个可溶区结构域(TmYidCP1)2.5(A)分辨率的晶体结构。
  Pf3是一个非SecYEG通道依赖性的YidC底物膜蛋白,它可以被YidC独立地转运插入到磷脂双分子层。我们利用体内光交联的实验手段,对YidC和Pf3之间相互作用的位点进行了研究。YidC的五次跨膜螺旋可以形成两个α五螺旋束,我们发现Pf3可以从这两个α-螺旋束所形成的TM3-TM5界面离开YidC的沟渠结构,继而进入磷脂双分子层。通过在YidC内部人为引入二硫键的方法,我们发现YidC中两个α-螺旋束周质侧的运动性对YidC的活性非常重要。负责连接第三个跨膜螺旋和第四个跨膜螺旋的P2loop包裹住了整个沟渠结构的周质侧一端,该loop上含有两个十分保守的负电性氨基酸,这些保守的负电氨基酸导致沟渠的周质侧一端呈现出一定程度的负电势。我们发现该负电氨基酸对于YidC的功能实现是必需的,因此推测P2loop上保守的负电性氨基酸在YidC催化底物进入磷脂分子层时发挥着重要作用。总之,我们的实验表明现YidC跨膜区的周质侧部分(包括P2loop)虽然远离YidC核心的亲水性沟渠结构域,却是一个与YidC的功能实现密相关的活性区域。

著录项

  • 作者

    辛彦龙;

  • 作者单位

    中国科学技术大学;

  • 授予单位 中国科学技术大学;
  • 学科 结构生物学
  • 授予学位 博士
  • 导师姓名 田长麟;
  • 年度 2018
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 酶;
  • 关键词

    膜蛋白; YidC酶; 晶体结构; 亲水性;

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