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基于肝芽形成的工程化肝脏构建

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摘要

英语缩略词表

前言

一、研究材料

二、研究方法

实验结果

一、人原代肝细胞在体外转化为肝前体样细胞进行扩增

二、HepLPCs具有肝前体细胞的特征

三、肝芽的形成、培养及检测

四、肝脏脱细胞生物支架的制备及检验

五、工程化肝脏的构建、培养及评价

讨论

参考文献

文献综述

攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢

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摘要

目的:　　中国是终末期肝病(End stage liver disease，ESLD)的高发地区，肝移植是治疗终末期肝病最重要的有效手段，但由于供体不足，大量肝衰竭患者无法得到及时救治。随着再生医学的发展，工程化肝脏技术为终末期肝病的治疗带来了新的希望。虽然目前研究众多，但是种子细胞的来源、三维结构的构建、血管网络和胆管结构的重建等一系列技术问题仍未得到很好的解决，制约着肝脏组织工程的发展。至今为止，尚未有任何一款组织工程肝脏可在真正意义上走向临床。　　肝脏组织工程最佳的种子细胞选择当属人的原代肝细胞。但是，原代肝细胞在体外培养时会逐渐失去其形态学特征和肝细胞特异功能，且它的体外扩增一直是肝再生领域尚未解决的瓶颈问题，此外还必须考虑伦理限制和细胞来源匮乏的问题。现有的解决方法主要包括:使用永生化肝细胞株替代原代肝细胞;将各类干细胞在体外定向分化为功能性肝细胞;通过采用导入外源基因的方法使体细胞去分化为诱导多能干细胞再进行肝向分化;将体细胞（例如成纤维细胞）直接基因重编程为诱导肝细胞。此外，近期研究团队和日本科学家几乎同时发现，通过小分子重编程技术，可以将小鼠的原代肝细胞去分化形成肝脏前体样细胞，该细胞可在体外进行规模化扩增，且分化后可重新获得成熟肝细胞的功能。这些类肝细胞在体外虽然具有一定的肝功能，但是它们各自存在着成熟度不足、有限性扩增、功能不稳定、异种移植排斥、生物安全性不高和致瘤风险等应用障碍。　　肝芽是具有发育能力和肝功能的初期肝脏组织，是肝脏发育的起源。最近，Takebe团队将人类诱导多能干细胞诱导分化的肝脏前体细胞(iPSC-HEs)与人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)、人类骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)在体外进行混合培养，建立了一种培育肝芽的方法。将这些肝芽移植入小鼠体内后，会快速地生成血管结构并与小鼠本身的血管连接，还可以表现出部分人类肝脏所特有的功能。然而这些肝芽的规模太小了，不能形成胆管结构，无法在体外进行功能分化和长期维持，移植后也未能在体内发育成完整的肝脏功能模块，所以在将这种方法引入临床前还需要进行相当大量的研究及优化。　　结合上述问题，本研究通过实现人原代肝细胞的体外扩增，以及基于肝芽的形成构建了具有生理功能和三维立体形态的工程化肝脏。为肝脏组织工程提供了全新的种子细胞来源，并为肝脏组织工程的构建开辟了新思路及新策略，对人类重要器官的再生和重建具有重要的科学意义。　　方法:　　1.通过两步灌流法分离获取人的原代肝细胞，用改良的肝细胞转化增殖培养基(TEM)进行扩增，并对增殖的肝细胞进行验证;　　2.将HepLPCs、HUVECs和hUC-MSCs按比例在体外混合培养，对形成的肝芽进行观察，并对其培养条件进行摸索和优化;　　3.采用ELISA、CCK8、生化检测以及PCR等检测手段确定体外培养的肝芽的细胞活力、肝细胞功能、以及是否具有肝胆双向分化的潜能;　　4.通过低温化学方法制备肝脏脱细胞生物支架，并对其进行去细胞效果、生物成分、形态结构以及细胞学毒性的检验;　　5.每上述三种细胞按比例混合后输入肝脏脱细胞生物支架内，构建工程化肝脏，并在体外用搭好的循环灌注培养系统进行培养;　　6.对在体外构建的工程化肝脏在不同时间点进行肝功能评价和组织学评价。　　结果:　　1.发现在特定的培养条件刺激下，人的原代肝细胞可以在体外转化为HepLPCs来进行规模化扩增;　　2.来自于不同供体的、不同培养时间点的、不同代数的HepLPCs具有肝前体细胞的特征，且在长期的培养过程中能够保持稳定，具有高度的相似性;　　3.建立HepLPCs、HUVECs和hUC-MSCs三种细胞共培养体系，发现它们在体外混合培养后可以形成肝芽;　　4.肝芽在体外维持培养时细胞的损伤和凋亡情况不明显，肝功能没有稳定上升，但胆系转录因子有所提高，发现肝芽存在向胆管分化的潜能;　　5.制备有效去除细胞成分、形态结构以及基质成分保存良好的肝脏脱细胞生物支架;　　6.基于肝芽的形成，将上述三种细胞按比例混合后输入肝脏脱细胞生物支架内，在体外构建具有生理功能和三维立体结构的工程化肝脏，并进行维持培养。12天后，观察到类胆管结构。　　结论:　　本研究通过对培养条件进行改良和优化，用小分子重编程技术使得人的原代肝细胞在体外可以去分化为HepLPCs来进行增殖，为肝脏组织工程提供了全新的种子细胞来源。随后发现HepLPCs可以与HUVECs和hUC-MSCs在体外混合培养形成肝芽。基于这种肝芽的形成，将三种细胞按比例混合后输入肝脏脱细胞生物支架内，经过灌注培养构建了具有三维立体结构和生理功能的工程化肝脏。我们的研究能够为肝脏组织工程的构建提供新的思路，对人类重要器官再生和重建具有重要的科学意义。

著录项

  • 作者

    曾敏;

  • 作者单位

    中国人民解放军海军军医大学海军军医大学;

  • 授予单位 中国人民解放军海军军医大学海军军医大学;
  • 学科 肿瘤学
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 鄢和新,王红阳;
  • 年度 2018
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 chi
  • 中图分类
  • 关键词

    工程化肝脏,三维立体结构,生理功能,肝芽形成;

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