两种富血小板纤维蛋白对人牙龈成纤维细胞的生长速度及质量影响的实验研究

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目的：　　通过实验，对比两种富血小板纤维蛋白,即改良型富血小板纤维蛋白（Advanced Platelet-Rich Fibrin,A-PRF)和富血小板纤维蛋白（Platelet-Rich Fibrin,PRF），与人牙龈成纤维细胞共同培养后对其生长速度及质量的影响，分析自体血液通过不同离心参数所得的两种生物材料各自在影响牙龈生长过程中的特点，为临床中选择对口腔局部软组织缺损再生修复和重塑材料，提供参考。　　方法：　　1.人牙龈成纤维细胞的获得、培养及鉴定：临床上收集8例下颌阻生智齿患者拔牙时切取的龈瓣，以MEM培养基进行组织块培养，取第三代细胞进行鼠抗人 Vimentin单抗、鼠抗人cytokeratin单抗染色,鉴定是否为成纤维细胞。当原代细胞生长至80~90％融合时，开始进行传代。　　2.制备PRF及A-PRF膜：抽取对应的牙龈提供者的肘静脉血每管5ml，以1500rpm，14min和2700rpm，12min分别离心获得A-PRF及PRF凝胶，专用工具盒压制成膜，纵向对称裁剪成4等份，称重，修剪至质量相等。　　3.A-PRF膜、PRF膜与细胞进行共同培养：实验设置分为A-PRF组、PRF组、空白组，同时调节细胞浓度为3×104个/ml，A-PRF组平铺A-PRF膜于培养板底部，PRF组平铺PRF膜于培养板底部，三组分别加入1000ul细胞悬液。　　4.于细胞加入后的1、3、5、7天，三组分别进行CCK-8检测，测定细胞增殖活性。　　5.于细胞加入后的1、3、5、7天，三组分别进行I型胶原纤维（COL1A1）的PCR检测。　　6.于细胞加入后的1、3、5、7天，A-PRF组与PRF组分别进行扫描电镜检测。　　7.统计学分析CCK-8结果，PCR检测结果。　　结果：　　1.细胞培养：8组标本均顺利取材培养，无污染，组织块培养第7天，于倒置相差显微镜下见部分组织块周围有细胞游离，呈梭形，胞体丰满边界清晰；第15天，可见组织块周围大量细胞密集布满，呈放射状，层叠状，较规律，胞体丰满边界清晰。　　2.细胞鉴定：取第三代细胞进行鉴定，8例标本全部对抗 Vimentin染色阳性，细胞核染为蓝色，胞浆染为棕色。8例标本对抗cytokeratin染色阴性，细胞核染为蓝色，胞浆不着色，表明细胞为间充质来源细胞。　　3.CCK-8计数：第1天，三组之间对比均无统计学意义（P＞0.05）。第3天，A-PRF组与PRF组对比，有统计学意义（P＜0.05），两组分别与空白组对照，均有统计学意义（P＜0.05）。第5天，A-PRF组与PRF组对比，有统计学意义（P＜0.05），A-PRF组与空白组对照有显著统计学意义（P＜0.01），PRF组与空白组对照，有统计学意义（P＜0.05）。第7天，A-PRF组与空白组对照有统计学意义（P＜0.05），PRF组与空白组对照，有显著统计学意义（P＜0.01），A-PRF组与PRF组之间对比无统计学意义（P＞0.05）。　　4.PCR检测Ⅰ型胶原纤维：第1天，三组之间无统计学差异（P＞0.05）；第3天，A-PRF组相对于PRF组有统计学意义（P＜0.05），A-PRF组与PRF组相对于空白组皆有统计学意义（P＜0.05），且A-PRF组共同培养与空白组对比，有显著统计学意义（P＜0.01）；第5天，A-PRF组相对于PRF组和空白组皆有统计学意义（P＜0.05），PRF组相对于空白组无统计学意义（P＞0.05）；第7天，A-PRF组相对于PRF组和空白组皆有统计学意义（P＜0.05），PRF组相对于空白组无统计学意义（P＞0.05）， A-PRF组与空白组对比，有显著统计学意义（P＜0.01）。　　5.扫描电镜观察：接种后第一天，可见完整A-PRF和PRF膜，其中A-PRF膜纤维蛋白呈粗大条索状交织，PRF膜纤维蛋白呈细密网络状交织，排列规则整齐，对比观察，可见 A-PRF膜纤维蛋白更加粗大褶皱， PRF膜纤维蛋白细密平整，接种的成纤维细胞散落在网中，胞体呈圆形边界清晰，未见明显黏附痕迹，网络间还可见少量红细胞嵌入。接种后第三天，A-PRF膜粗大纤维结构仍清晰且较规律，PRF膜不再致密平整，变得开始凹凸不平。网状结构中少量成纤维细胞黏附，形态不再为圆形，形态扁平且变长，逐渐贴附于纤维蛋白表面。接种后第五天，A-PRF膜表面变得粗糙，仍可隐约见纤维蛋白条索轮廓，PRF膜较第三天更加粗糙，可见小缝隙。成纤维细胞密度变大，呈梭形或星形，伸出伪足，紧密贴附于纤维蛋白，有的可见伪足深入缝隙之中。接种后第七天，A-PRF膜条索轮廓基本消失，但仍旧有完整结构，纤维蛋白仍细密交织成网，PRF膜出现缺损。A-PRF和PRF膜表面都大量黏附成纤维细胞，梭形，伪足嵌入网中，贴附紧密。　　结论：　　1.成纤维细胞培养鉴定结果所示，所得细胞均为实验目标细胞，即成纤维细胞，该实验方法可行。　　2.A-PRF、PRF均能提高成纤维细胞增殖活性，且在3-5天促进作用最为明显，A-PRF总体促进效果优于PRF。　　3.在创伤愈合早期（术后7天内），A-PRF促进胶原纤维沉积的能力优于PRF，且优于空白组。　　4.A-PRF以及PRF都能为细胞的黏附增殖迁徙提供良好的支架和环境。

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作者
焦志立;
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作者单位

西南医科大学;

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授予单位西南医科大学;
学科口腔医学
授予学位硕士
导师姓名孙勇;
年度 2017
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正文语种 chi
中图分类
关键词
富血小板纤维蛋白,牙龈成纤维细胞,生长速度,再生修复材料;

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