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茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞对急性肝衰竭大鼠线粒体凋亡途径的影响

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前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

1.1 实验动物

1.2 动物饲养条件

2 主要实验试剂

2.1 动物实验造模药选择

2.2 造模后各组大鼠予以相应干预。

2.3 实验所需试剂

3 主要实验仪器

4 实验方法

4.1 骨髓间充质干细胞的提取、分离及培养传代

4.2 实验大鼠分组及急性肝衰竭模型的建立

4.3 各组干预措施

4.4 收集血液及组织标本

4.5 肝功能指标检测

4.6 肝组织病理切片制作

4.7 肝组织线粒体电镜标本制作

4.8 通过Western-blot法检测各组肝组织中Cyt-c与Caspase-9的蛋白表达

结果

1 大鼠BMSCs的形态观察及细胞鉴定

1.1 大鼠BMSCs的形态学观察

1.2 流式细胞术鉴定BMSCs表型

2 建立急性肝衰竭大鼠药物模型及一般情况观察

2.1 各组大鼠造模后一般情况

2.2 各组大鼠死亡情况

3 各组大鼠肝功能指标水平

4 各组大鼠病理HE染色结果

5 各组大鼠肝脏线粒体电镜观察

6 各组大鼠肝组织中Cyt-c与Caspase-9的蛋白表达水平

讨论

1 选择硫代乙酰胺造模的原因

2 BMSC的分离纯化培养

3 BMSC在急慢性肝病中的作用

4 细胞凋亡与急性肝衰竭

5 清热解毒健脾除湿中药在急性肝衰竭中的应用

6 本次实验的联合法对急性肝衰竭的作用

7 本次实验的不足之处

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述:中医药在肝衰竭治疗中的机制研究进展

声明

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摘要

目的：通过茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞治疗急性肝衰竭实验大鼠，观察联合法对ALF大鼠肝细胞线粒体凋亡途径的影响，从抑制肝脏细胞凋亡、保护线粒体等方面进一步研究茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞对急性肝衰竭的治疗机制与相互作用。　　方法：1、选取体重约为150g左右的SPF级雄性大鼠，通过全骨髓贴壁培养法提取、培养骨髓间充质干细胞，体外细胞传代提纯、排除杂质细胞后，经过流式细胞术鉴定其表型分子，冻存后备用。2、选用体重约为250g左右的清洁级SD大鼠，共80只，随机平均分为8组：正常组、正常中药组、正常干细胞组、模型组、复方甘草酸苷组、中药治疗组、干细胞治疗组、中药+干细胞联合治疗组（下称联合治疗组）。正常饲养1周后进行造模。模型组、复方甘草酸苷组、中药治疗组、干细胞治疗组、联合治疗组分别予以硫代乙酰胺300mg/kg腹腔注射，每24小时1次，连续3日注射成模。造模开始即监测实验大鼠生命体征、病理情况等，通过检测血清ALT、AST、TBIL与肝组织病理标本等，可明确已成功完成急性肝衰竭大鼠模型制备。3、通过标准药物剂量折算，复方甘草酸苷组予以复方甘草酸苷片15mg/kg灌胃，每日2次，正常中药组、中药治疗组、联合治疗组予以茵陈四苓颗粒1.5g/kg灌胃，每日2次，剩余各组均予以等量生理盐水灌胃。同时硫代乙酰胺第一次给药后12小时内，正常干细胞组、联合治疗组、干细胞治疗组予以第3代骨髓间充质干细胞悬液约1ml门静脉注射。4、造模成功48小时后，大鼠麻醉后开腹，收集腹主动脉血以检测大鼠血清中AST、ALT与TBIL水平，比较各治疗组大鼠血清肝功能恢复情况；右肝相近部位取组织，HE染色制备肝脏病理标本，观察各组大鼠肝脏病理情况；透射电镜观察肝细胞线粒体超微结构；通过Western-blot法检测各实验组大鼠肝组织中Cyt-c与Caspase-9的相对蛋白表达。　　结果：1、本实验采用提取原代细胞培养后72小时全量换液的方式，成功传至第3代并予以细胞扩增后，细胞形态大小均匀一致，旋涡样紧密分布，部分呈集落生长。通过流式细胞仪鉴定其表面分子，结果表明，第3代BMSCs表面分子高表达CD29（98.7%）、CD44（99.7%），低表达CD34（12.9%）、CD45（18.5%）。此结果与骨髓间充质干细胞表面鉴定特性相吻合。2、本实验予以硫代乙酰胺300mg/kg，连续腹腔注射3日制备ALF大鼠模型，造模24小时后，各实验组大鼠自主饮食、水减少，反应变为迟钝，毛发蓬松晦暗。3、造模48小时后，模型组、中药治疗组、干细胞治疗组、复方甘草酸苷组、联合治疗组血清中ALT、AST与TBIL的值较正常组明显升高，模型组升高程度尤为明显。各干预组相较于模型组而言，肝脏生化指标下降均有统计学意义（P＜0.05）。各治疗组中相比，联合治疗组表达ALT、AST及TBIL的程度均最低，相较于其他治疗组，差异明显具有统计学意义（P＜0.05）。4、大鼠肝脏病理切片提示：模型组肝脏损害严重，结构破坏紊乱，部分肝细胞出现水肿，凋亡细胞出现；其余各治疗组肝脏损害程度稍轻，其中联合治疗组损伤程度最轻。5、肝组织线粒体透射电镜观察结果与病理组织结果类似，模型组肝组织线粒体明显肿胀，嵴模糊不清，部分可见自噬小体形成；其余各治疗组线粒体损伤较模型组更轻，其中联合治疗组部分线粒体可见内脊轻度扩张。6、造模48小时后，模型组、中药治疗组、干细胞治疗组、复方甘草酸苷组、联合治疗组肝组织中Caspase-9、Cyt-c的蛋白表达较正常组明显升高，其中模型组升高程度更为显著。各治疗组相较于模型组而言，表达结果均有统计学意义（P＜0.05）。各治疗组间相比，联合治疗组表达Cyt-c和Caspase-9的水平均最低，相较于其他治疗组而言，差异明显具有统计学意义（P＜0.05）。　　结论：1、全骨髓贴壁法是目前最为成熟的培养间充质干细胞的方法之一，通过此法进行原代骨髓间充质干细胞的体外培养与传代纯化，可以获得纯度较高、包含较少杂细胞的骨髓间充质干细胞。2、使用硫代乙酰胺300mg/kg、每24小时腹腔注射，连续3日可以成功完成急性肝衰竭大鼠模型的制备，大鼠肝脏损害严重，符合急性肝衰竭标准。3、茵陈四苓颗粒与骨髓间充质干细胞联合作用于急性肝衰竭大鼠，可有效降低实验大鼠血清中肝脏生化水平，保护肝脏超微结构，减轻细胞凋亡水平，且二者联用治疗效果较中药治疗组、干细胞治疗组更佳。4、推测茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞治疗ALF大鼠的可能机制与保护线粒体结构、减少促凋亡蛋白Cyt-c的释放、下调凋亡相关因子Caspase-9的蛋白表达有关。

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