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ABr-DRs大鼠的继续培育、表型探索及其BRS低下的疑核AMPA受体机制研究

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摘要

英文缩略词及汉英全称

前言

一、研究背景

二、前期工作基础

三、研究内容

四、研究意义

实验材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

三、统计分析

实验结果

一、第26代至第29代模型大鼠的鉴定、筛选和培育

二、ABR-DRs出现代谢综合征表现

三、ABR-DRs未表现出心律失常的易感性、心肌肥厚和心功能异常

四、ABR-DRs疑核AMPA受体功能异常

五、ABR-DRs疑核GluR2表达降低

六、过表达疑核GluR2对ABR-DRs的BRS、血压和血糖血脂等指标的影响

讨论

结论

参考文献

综述

在读期间发表论文及获奖情况

致谢

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摘要

动脉压力感受性反射(Arterial baroreflex，ABR)是稳定动脉血压最重要的负反馈调节系统。动脉压力感受性反射功能可以用压力感受性反射敏感性(Baroreflex sensitivity，BRS)来表示。近年来研究发现，BRS低下与高血压、心律失常、脑卒中、心肌梗死及心力衰竭等心脑血管疾病密切相关，但现有研究无法完全阐明BRS低下是心血管疾病的重要致病因素。BRS低下病人很多合并有交感功能亢进，并且大量的研究结果也表明交感神经的过度激活，将会诱发许多心血管疾病，包括心衰、高血压、心梗、房颤、室颤等等。因此需要更多的实验数据证实单纯的BRS低下与心脑血管疾病发生发展的关系。　　本教研室着手进行了自发性反射功能缺陷模型大鼠的培育工作，将BRS＜0.6ms/mmHg的大鼠定义为动脉压力感受性反射功能缺陷大鼠(Arterial baroreflex-deficient rats，ABR-DRs)，而BRS＞0.8ms/mmHg的大鼠则定义为动脉压力感受性反射正常大鼠（Arterial baroreflex-normal rats，ABR-NRs），采用先近亲繁殖后筛选的方法，开展了ABR-NRs和ABR-DRs模型大鼠的培育工作。在培育过程中，两株动物的BRS逐步出现了明显差异。表型方面，较ABR-NRs动物，ABR-DRs动物呈现出现轻度高血压症状。但在其他心血管疾病方面，如心肌肥厚、心力衰竭、心律失常等，尚缺乏相关的实验数据。　　在BRS低下机制研究方面，我们教研室前期研究工作对此也进行了初步探索。已经确定ABR-DRs大鼠的动脉压力感受性反射功能缺陷主要表现在迷走功能方面，而交感功能正常，因此ABR-DRs是一株单纯的BRS低下动物模型;利用离体膜片钳技术测定ABR-DRs动物的疑核(Nucleus ambiguous，NA)自发性电活动显著减弱。进一步的实验证实谷氨酸的AMPA受体与疑核自发电活动降低密切相关。但AMPA受体在BRS低下的关键作用仍需要进一步的数据支持。同时AMPA受体有很多亚型，哪个亚型在其中发挥作用仍需研究。　　我在前期工作基础上，进一步鉴定、筛选和培育ABR-DRs以及对照ABR-NRs;进一步的表型测定显示，与ABR-NRs动物比较，ABR-DRs体重增加，血脂、血糖水平显著升高，结合血压数据猜测，ABR-DRs表现出显著的代谢综合征。同时，与ABR-NRs相比，ABR-DRs动物并未表现出心肌肥厚、心功能异常以及心律失常的易感性。关于BRS低下的机制研究。AMPA受体主要有4个亚基，其中GluR2亚基与AMPA功能和表达关系最为密切。后续的研究主要围绕GluR2开展。利用GluR2过表达慢病毒转染等技术手段，明确疑核的GluR2可能是BRS低下的关键蛋白。过表达GluR2可显著改善反射功能，降低血压，改善代谢综合征。　　具体实验和结果如下：　　实验一：第26代至第29代模型大鼠的鉴定、筛选和培育　　采用清醒测压技术测定每代ABR-NRs和ABR-DRs动物的BRS、血压和心率，淘汰各组BRS不符合或血压不正常的动物及其子代，保留并近亲交配符合标准的动物子代。到第29代，ABR-DRs的BRS合格率已稳步提高至90％，ABR-NRs的BRS合格率达到了80％。虽然筛选中严格控制父代血压，ABR-DRs血压却明显高于ABR-NRs(约10mm Hg)。更为重要的是，两组动物高血压发生率差异也越发显著，ABR-NRs高血压发生率为0(n=15)，而ABR-DRs高达62.5％（n=15）。　　实验二：ABR-DRs出现代谢综合征表现　　对第29代两株大鼠的体重、随机血糖、空腹血糖、血脂四项和肝肾功能相关代谢指标进行测定，结果发现，与ABR-NRs比较，ABR-DRs动物的体重明显增加，空腹血糖、糖化血清蛋白、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白以及血清白蛋白均显著升高。糖耐量实验，与ABR-NRs相比，在0、15、30、60、120min各个时间点，ABR-DRs的血糖水平均显著升高，血糖的曲线下面积显著增加。这些指标的异常符合临床上的代谢综合征表现。　　实验三：ABR-DRs未表现出心律失常的易感性、心肌肥厚和心功能异常　　使用乌头碱静脉微量注射诱导两株大鼠发生致死性心律失常，采用乌头碱导致心律失常的临界剂量和体重比值来评价动物心律失常的敏感性。　　结果：发现，导致两株大鼠心室早搏、心室纤维颤动和心脏停搏的乌头碱计量指数均无明显差异。心功能测定：8月龄ABR-DRs与ABR-NRs，使用小动物B超机测定每搏输出量、射血分数、室短轴缩短几率，心输出量等，均无显著差异。麻醉处死动物，取心脏、主动脉进行形态学测定。与ABR-NRs相比，除主动脉重量表现出一定差异（11.6±1.4mg/cm in ABR-NRs vs13.8±1.5mg/cm in ABR-DRs，P=0.027）以外，ABR-DRs的左心室、右心室等脏器指数均无显著差异，未表现出心肌肥厚症状。　　实验四：ABR-DRs疑核AMPA受体功能异常　　向两株大鼠疑核微量注射L-谷氨酸激活AMPA受体，或CNQX抑制AMPA受体。疑核微量注射L-谷氨酸(1nM，50nL)进行定位，若心率下降表明定位准确。每个实验结束后，向疑核注射100nL2％的滂胺天蓝溶液进行定位标记。首先向疑核微量注射L-谷氨酸(1nM，50nL)，ABR-NRs的BRS增加约51％，ABR-DRs的BRS增加约29％(P＜0.01)。再而向疑核微量注射CNQX（0.5nM，50nL），削弱或反转L-谷氨酸引发的BRS升高，结果显示，ABR-NRs的BRS显著下降(P＜0.01)，ABR-DRs的BRS下降幅度无显著差异。以上数据表明AMPA受体参与了疑核功能异常和反射功能低下。　　实验五：ABR-DRs疑核GluR2表达降低　　AMPA受体是脑内引起兴奋性突触后电位的主要受体。是由GluR1、GluR2、GluR3、GluR4构成的同四聚体或异四聚体。其中GluR2亚基决定了AMPA受体对Ca2+的通透性，与AMPA功能和表达关系最为密切。因此本课题重点研究疑核的GluR2亚型。　　向大鼠结状神经节注射逆向荧光示踪剂，借此标记疑核，1周后取延髓作冰冻切片，利用组织免疫荧光技术，激光共聚焦测定疑核的GluR2。同ABR-NRs相比，ABR-DRs动物疑核的GluR2数目(Amount)和平均光密度值(AOD)均显著低下(Amount,12％±1.6％in ABR-DRs vs22％±1.1％in ABR-NRs;AOD,9.5±0.2inABR-DRs vs13.4±0.6in ABR-NRs,P＜0.01,n=5)。　　实验六：慢病毒过表达疑核GluR2增加ABR-DRs的BRS、血压，改善代谢综合征　　ABR-DRs脑立体定位疑核注射GluR2过表达慢病毒、对照和假手术，3周后取延髓冰冻切片，通过组织免疫荧光确定转染效率。病毒过表达后NA的GluR2表达数目上调约10％。成功感染慢病毒，继续常规饲养1月后，采用清醒测压技术检测BRS和血压。测定发现，与假手术和对照组相比，过表达组的BRS数值明显增加（假手术组0.33±0.067ms/mmHg vs过表达组0.59±0.20ms/mmHg，P＜0.01），血压有降低趋势。　　过表达组、对照组和假手术组动物术后常规饲养4个月，测定空腹状态下的体重、血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、血糖、瘦素、谷丙转氨酶、尿素氮、尿酸、肌酐。　　结果：显示，较对照组和假手术组，过表达组的血脂、血糖水平均有显著降低，代谢综合征减轻。　　结论：　　（一）ABR-DRs主要表现为代谢综合征，出现超重、高血压、高血糖、高血脂等心血管危险因素的汇集状态。但未表现出心肌肥厚、心律失常和心功能异常。　　（二）ABR-DRs动物疑核的AMPA受体功能异常。其亚型GluR2缺陷可能是BRS低下关键分子机制。　　（三）过表达疑核的GluR2可改善ABR-DRs动物的动脉压力感受性反射功能，降低血压、血脂、血糖等，改善代谢综合征。

著录项

  • 作者

    张莹;

  • 作者单位

    中国人民解放军海军军医大学海军军医大学;

  • 授予单位 中国人民解放军海军军医大学海军军医大学;
  • 学科 药理学
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 苏定冯;
  • 年度 2018
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 chi
  • 中图分类
  • 关键词

    心脑血管疾病,发病机制,动脉压力感受性反射,AMPA受体;

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