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【6h】

不同来源微血管内皮细胞培养方法的建立及生物学特性比较

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前言

材料与方法

1.实验动物

2.主要实验试剂DMEM/F12培养基

3.主要实验仪器超净工作台

4.实验器械及耗材

5.试剂的配制、分装及保存

6.实验方法

7、统计学方法

结果

1.AMECs及PMECs的分离培养方法建立

2.AMECs及PMECs的比较

讨论

1.AMECs及PMECs的分离培养意义及方法建立

2.AMECs及PMECs的标志物

3.AMECs及PMECs的功能

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

综述:微血管内皮细胞的研究进展

致谢

声明

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摘要

目的：分离小鼠脂肪微血管内皮细胞（AMECs）及肺微血管内皮细胞（PMECs），建立微血管内皮细胞（MECs）的培养方法。比较两种MECs生物学特性的差别。为我们下一步研究MECs对造血干细胞（HSCs)体外扩增的影响奠定基础，同时也给MECs的相关实验研究及临床应用提供依据。　　方法：　　1、微血管内皮细胞分离培养方法的建立：（1）提取C57小鼠的附睾旁脂肪组织和肺组织，用0.1％I型胶原酶在37℃条件下摇床消化，用70um滤器过滤细胞悬液。（2）寻找分离附睾旁脂肪组织的最佳鼠龄，分组：①4w，②6w，③8w，④10w，判断标准：每ml脂肪组织所含种子细胞数量。（3）探索最佳首次换液的时间，分组：①24h，②48h，③72h，判断标准：能否获得原代MECs。（4）寻找原代培养的最佳接种密度，分组：①5×105/cm2，②1×106/cm2，③2×106/cm2，判断标准：培养至第8天的细胞形态、数量。（5）探索明胶包被培养皿的最适宜浓度，分组：①0，②0.1%，③0.5%，④1%，判断标准：收获的原代MECs细胞数。　　2、对AMECs与PMECs的生物学特性进行比较：（1）比较平均每只小鼠获得的脂肪微血管内皮细胞（AMECs）和肺微血管内皮细胞（PMECs）数量。（2）倒置显微镜观察AMECs及PMECs的生长、形态变化。（3）流式细胞分析技术及免疫荧光技术测得AMECs和PMECs的CD31、CD34、CD45、vWF的表达。（4）绘制生长曲线比较AMECs和PMECs的增殖能力。（5）将获得的原代AMECs和PMECs按3:1进行传代，比较两种细胞的传代能力及传代细胞形态。（6）采用10ng/mlVEGF培养两种MECs观察形态特征。　　结果：　　1.微血管内皮细胞分离培养的最佳方法：（1）采用酶消法能够成功分离两种组织获得种子细胞。（2）4周龄小鼠单位体积脂肪获得的种子细胞数为4.67±0.58（106），6周组为10.18±0.28（106），8周组为9.94±0.35（106），10周组为6.72±0.39（106）；6周组及8周组较4周组、10周组多（P<0.05）,6周组与8周组比较无差异(P>0.05）。（3）24h首次换液可获得原代AMECs和PMECs；48h及72h首次换液，杂细胞生长占优势，无法获得原代MECs。（4）1×106/cm2为原代最佳接种密度；5×105/cm2细胞稀疏，MECs增殖不良；2×106/cm2细胞接触抑制，死亡脱壁。（5）培养至第8天，AMECs的未包被明胶组的200×镜下细胞数为148.33±13.54，0.1%组为201.83±12.97，0.5%组为191.50±11.52，1%组为193.00±8.67；明胶包被的3组得到的AMECs多于未包被组（P<0.05）,而3种浓度间无差异（P>0.05）。培养至第10天， PMECs的未包被明胶组的200×镜下细胞数为182.33±11.03，0.1%组为219.50±11.4，0.5%组为212.00±12.39，1%组为213.00±12.12；明胶包被的3组得到的PMECs多于未包被组（P<0.05）,而3种浓度间无差异（P>0.05）。　　2.AMECs与PMECs的生物学特性比较的结果：（1）原代培养的AMECs及PMECs均在第48h-72h形成细胞团，第4天左右细胞呈多角形、卵圆形， AMECs在第10天、PMECs在第14天形成“铺路石样”改变，细胞表面可观察到微绒毛。（2）每只小鼠获得的AMECs种子细胞为2.08±0.57（×106）， PMECs种子细胞为19.07±0.72（×106），二者有差异(P<0.05)。每只小鼠获得的AMECs原代细胞数为0.26±0.05（×106），PMECs原代细胞数为3.37±0.18（×106），二者有差异(P<0.05)。（3）AMECs及PMECs均不表达CD45。AMECs的CD31、CD34、vWF表达率分别为44.28%、30.15%、76.1%，PMECs的CD31、CD34、vWF表达率分别为45.8%、57.48%、81.39%。（4）传代的两种细胞生长均快于原代细胞，与原代细胞形态相比无明显差异。（5）生长曲线显示PMECs缓慢增殖期较AMECs长；AMECs生长高峰为接种后3-6天，PMECs生长高峰为接种后4-7天。（6）10ng/mlVEGF培养两种细胞，第6天可见细胞伸展、迁移融合形成细胞索，细胞索相互之间连接沟通。　　结论：　　1．本研究建立了经济有效、简便、可重复的分离培养AMECs及PMECs的最佳方案：24h首次换液、1×106/cm2接种密度、0.1%明胶、2ng/mlVEGF、6-8周龄小鼠。　　2．AMECs的细胞形态、特异性标志、细胞传代、生长曲线与PMECs类似；每只小鼠收获的AMECs和PMECs的数量有差异。

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