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Chitosan与Pam3CSK4、MPL联合应用增强防龋疫苗PAc的防龋免疫保护作用

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防龋疫苗已经研究了几十年，早期的研究者发现将灭活的变形链球菌对实验动物进行接种能显著减轻其牙齿的龋坏程度，然后有研究报道葡糖基转移酶（glucosyltransferase，GTF）作为抗原免疫小鼠可以达到这种免疫保护效果。1987年DanielJ.Smith和MartinA.Taubman将远缘链球菌来源的GTF接种至人类口腔，其腮腺分泌的唾液中出现分泌型免疫球蛋白A（immunoglobulinA，IgA)且口腔中变形链球菌的数量减少。自此越来越多的研究者参与到防龋免疫这项研究中。变形链球菌已被证实是主要的致龋菌，其细菌中的主要毒力因子GTF和细胞表面纤维蛋白（Cellsurfaceproteinantigen,PAc）均被作为防龋疫苗研发的候选疫苗。　　接种疫苗的目的是保护机体免受疾病的伤害，同理，防龋疫苗的研究目的是保护牙齿免受龋病的伤害。重组蛋白PAc作为防龋疫苗对小鼠进行免疫，虽能诱导唾液中IgA抗体产生和抑制变形链球菌定植到牙齿表面，但其介导产生的免疫反应强度低，不能提供足够的免疫保护使机体避免龋病损害。因此需要佐剂协助PAc介导产生足够有效且持久的免疫保护作用。　　佐剂，作为疫苗的重要组成部分，可通过影响机体中各种淋巴细胞对抗原的特异性反应，达到增强疫苗免疫的效果。疫苗佐剂主要通过淋巴细胞的特异性激活，增强机体的细胞免疫，增强宿主先天性免疫反应和适应性免疫反应，增加有效的抗体分泌量和持久性以达到期望的免疫效果。模式识别受体（patternrecognitionreceptors,PRRs）,尤其是Toll样受体（Toll-likereceptors,TLRs）和NOD样受体（NOD-likereceptors,NLRs）是这几年疫苗佐剂研究的热点，它们通过激活固有免疫来影响机体的免疫应答的类型和免疫强度，且可影响获得性免疫。目前这些研究TLRs和NLRs的免疫激活作用的制剂包括Pam3CSK4(TLR2配体),胞壁酰二肽（muramyldipeptid，MDP,NOD2配体)，D-isoGlu–meso-DAP(iE-DAP，NOD1配体)，单磷酰脂质A（monophosphoryllipidA，MPL,TLR4配体)和壳聚糖（chitosan，NLRP3配体）等。虽然很多优秀的疫苗的作用机制还不清楚，有研究表明它们通过TLRs激活树突状细胞（dendriticcells，DCs）。PRRs配体作为佐剂在疫苗应用方面的潜力正在不断地被研究者们发现和了解。　　PRRs配体可以通过联合使用来协同和/或平衡彼此的免疫调节作用，例如TLR4-NLRP3配体联合使用能够增强炭疽疫苗的免疫保护作用，使机体在单次免疫后能够产生足够强度的炭疽致命毒素中和抗体。TLR4-TLR7配体组合在树突状细胞中触发TLRs可协同诱导产生细胞因子，从而增强T细胞反应。有研究证明用含有抗原和TLR4-TLR7配体组合的纳米颗粒免疫小鼠能协同促进抗原特异性中和抗体的产生，淋巴结中生发中心和浆细胞反应的持续性增强可持续1.5年。TLR和/或NLR配体联合使用可有效增强机体的免疫应答，并增强疫苗的免疫效果。　　在本研究中，我们从5种TLR和/或NLR配体中选择出两种组合作为防龋疫苗PAc的免疫增强添加剂，以期提高针对龋病的PAc疫苗的抗体应答。因此，我们研究了chitosan+Pam3CSK4或chitosan+MPL联合应用是否能提高小鼠的抗体滴度，抑制变形链球菌的定植以及这两种组合是否能增强对经口腔感染变形链球菌小鼠的防龋作用。　　第一部分：PRRs配体对OVA特异性TCR转基因小鼠的OVA特异性反应的影响　　实验目的：构建OVA特异性TCR转基因小鼠，通过对OVA特异性TCR转基因小鼠进行OVA+PRRs配体免疫，检测PRRs配体对其OVA特异性反应的影响。实验方法：对CD45.1×OTⅡ小鼠的脾脏和淋巴结的单细胞悬液进行细胞分选，分选出CD4+CD45.1+TCRVα+TCRVβ+CD62L+CD25?T细胞回输至C57BL/6小鼠体内，构建OVA特异性TCR转基因小鼠，分别将Pam3CSK4，MDP，iE-DAP，MPL,chitosan和OVA共同免疫小鼠，免疫3天后检测小鼠颌下淋巴结中OVA特异性T细胞。　　实验结果：OVA特异性TCR转基因小鼠在免疫3天后，计算相应的引流淋巴结中细胞数量，与OVA组相比，各实验组免疫侧颌下淋巴结中细胞数量有所增加，其中，OVA+Pam3CSK4免疫组、OVA+MPL免疫组和OVA+chitosan免疫组有统计学差异（P＜0.001或P＜0.05）。流式细胞检测结果显示，OVA+Pam3CSK4免疫组和OVA+MPL免疫组的颌下淋巴结中CD45.1×OTⅡT细胞数量明显增加，与OVA组相比有统计学差异（P＜0.001）。　　结论：Pam3CSK4，MPL，chitosan能够影响OVA特异性TCR转基因小鼠的OVA特异性反应。　　第二部分：PRRs配体的佐剂增强作用的实验研究　　实验目的：通过对C57BL/6小鼠进行OVA+PRRs配体免疫，检测PRRs配体对小鼠OVA特异性反应的影响。　　实验方法：分别将Pam3CSK4，MDP，iE-DAP，MPL，chitosan和OVA共同免疫C57BL/6小鼠，1周后加强免疫，采集各组小鼠血清，用酶联免疫吸附法测定血清中特异性抗OVAIgG1和IgG2b抗体水平；分离免疫侧颌下淋巴结制备单细胞悬液，流式抗体染色后进行流式细胞术检测，计算各组小鼠颌下淋巴结中CD4+T细胞和CD8+T细胞数量，测定CD4+T细胞中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-17的分泌情况。　　实验结果：MDP、chitosan、Pam3CSK4、MPL、iE-DAP分别作为佐剂联合OVA免疫小鼠2周后，血清中特异性抗OVAIgG1抗体和IgG2b抗体水平高于无佐剂的OVA免疫组，其中，OVA+Pam3CSK4免疫组抗OVAIgG1抗体水平最高，OVA+chitosan免疫组次之，OVA+MPL免疫组次次之；OVA+MPL免疫组和OVA+Pam3CSK4免疫组抗OVAIgG2b抗体水平最高。对小鼠淋巴结细胞进行流式细胞术检测，OVA+MPL免疫组的CD4+T细胞和CD8+T细胞最多，且CD4+T细胞的IFN-γ、IL-2和IL-4表达明显高于OVA免疫组（P＜0.05）。　　结论：综合小鼠血清中抗体结果和淋巴结的流式结果，MPL，Pam3CSK4和chitosan影响C57BL/6小鼠的OVA特异性反应。　　第三部分：PRRs配体联合使用的免疫增强效果的实验研究　　实验目的：通过对C57BL/6小鼠进行OVA+chitosan+Pam3CSK4或OVA+chitosan+MPL免疫，检测小鼠血清中特异性抗OVA抗体水平和小鼠颌下淋巴结中树突状细胞及其亚群的情况。　　实验方法：分别用OVA+chitosan+Pam3CSK4、OVA+chitosan+MPL免疫C57BL/6小鼠，1周后加强免疫，采集各组小鼠血清，用酶联免疫吸附法测定血清中特异性抗OVAIgG1、IgG2b抗体水平；分离免疫侧颌下淋巴结制备单细胞悬液，流式抗体染色后进行流式细胞术检测，计算各组小鼠颌下淋巴结中DCs的数量，按照口腔中DCs亚群的特征检测颌下淋巴结中DCs亚群的分布情况。实验结果：OVA+chitosan+Pam3CSK4免疫组和OVA+chitosan+MPL免疫组血清中特异性抗OVAIgG1抗体和IgG2b抗体水平均远高于无佐剂的OVA免疫组，且高于OVA+chitosan免疫组。OVA+chitosan+Pam3CSK4免疫组颌下淋巴结中的DCs数量显著高于OVA免疫组（P＜0.05），mDCs和CD103+间质DCs均有显著增高（P＜0.01或P＜0.05）。　　结论：chitosan+Pam3CSK4和chitosan+MPL联合使用，促进了小鼠血清中特异性抗体的产生，具有免疫增强效果。　　第四部分：小鼠龋齿保护模型的建立与检测　　实验目的：通过小鼠龋齿保护模型探索PAc+chitosan+Pam3CSK4和PAc+chitosan+MPL是否具有龋齿保护作用。　　实验方法：将chitosan+Pam3CSK4和chitosan+MPL作为佐剂与PAc联合免疫小鼠，口腔接种S.mutansMT8148，给予致龋饲料，建立小鼠龋齿模型。酶联免疫吸附法测定小鼠血清和唾液中特异性抗PAc抗体水平，检测S.mutan在小鼠口腔中的定植情况，测量小鼠体重增长情况和血清生化指标，microCT检测小鼠磨牙龋坏情况并计算牙釉质和牙本质的残存体积。　　实验结果：PAc+chitosan+Pam3CSK4和PAc+chitosan+MPL能够显著增加小鼠血清和唾液中特异性抗PAc抗体水平，S.mutans的定植受到抑制，牙釉质和牙本质残存体积较多，龋损程度降低，且S.mutans的定植情况和抗PAc抗体水平呈显著性负相关，龋损程度与抗PAc抗体水平呈显著性负相关。各组小鼠间的生长情况与血清生化指标无明显差别。　　结论：PAc+chitosan+Pam3CSK4和PAc+chitosan+MPL具有龋齿保护作用。

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