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人工核酸切割分子与核酸相互作用的研究

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第一章绪论

1.1研究人工核酸切割试剂的意义

1.2人工核酸切割试剂的研究进展

1.2.1以寡聚核酸为识别系统的定点切割系统

1.2.2以PNA为识别系统的定点切割试剂

1.2.3以多肽为识别系统的定点切割试剂

1.2.4以多聚酰胺为识别系统的定点切割试剂

1.2.5丝组二肽及其聚酰胺缀合物对核酸的水解和识别

1.3几种典型水解及氧化机理小分子的研究进展

1.3.1苯并咪唑类化合物的性质及其应用

1.3.2大环多胺及其金属配合物的研究进展

1.3.3抗坏血酸及其衍生物的性质和应用

1.4人工核酸断裂试剂的断裂机理

1.4.1自由基断裂机理

1.4.2酯水解断裂机理

1.4.3消除断裂机理

1.5本论文主要工作及创新点

参考文献

第二章水解及氧化型聚酰胺切割分子的设计合成

2.1实验材料及方法

2.1.1主要试剂

2.1.2实验仪器

2.2化合物的合成

2.2.1聚酰胺分子的合成

2.2.2聚酰胺-双苯并咪唑缀合物的合成

2.2.3聚酰胺-大环多胺缀合物的合成

2.2.4聚酰胺-双大环缀合物的合成

2.2.5聚酰胺-抗坏血酸缀合物的合成

2.2.6金属配合物的合成

2.3本章小节

参考文献

第三章水解及氧化型聚酰胺切割分子与核酸相互作用研究

3.1前言

3.2实验材料及方法

3.2.1主要试剂

3.2.2实验仪器

3.2.3贮存液的配制

3.2.4核酸切割实验通法

3.2.5琼脂糖凝胶电泳条件

3.2.6核酸熔点实验

3.2.7紫外光谱滴定实验

3.2.8荧光光谱实验

3.2.9圆二色光谱实验

3.2.10 Maldi-Tof质谱条件

3.3聚酰胺切割分子对核酸的断裂能力研究

3.3.1小分子断裂核酸的凝胶电泳分析

3.3.2调控核酸双链断裂的数值分析及模型

3.3.3 Maldi-Tof质谱分析核酸断裂位点

3.4聚酰胺切割分子与核酸的结合能力研究

3.4.1圆二色光谱分析

3.4.2荧光淬灭分析

3.4.3核酸熔点分析

3.4.4紫外滴定分析

3.4.5 Maldi-Tof质谱分析

3.4.6结合能力的量化

3.5本章小节

参考文献

第四章多胺类金属配合物的设计合成

4.1前言

4.1.1未知条带的产生

4.1.2未知条带的分析

4.2化合物的设计

4.3实验材料及方法

4.3.1主要试剂

4.3.2实验仪器

4.4化合物的合成

4.4.1 1,4,7-三氮杂环壬烷及其衍生物的合成

4.4.2侧链修饰的IDB衍生物的合成

4.4.3侧链修饰的环多胺衍生物的合成

4.5本章小节

参考文献

第五章多胺类金属配合物对核酸的凝聚及断裂作用研究

5.1实验材料及方法

5.1.1主要试剂

5.1.2实验仪器

5.1.3贮存液的配制

5.1.4核酸凝聚及切割实验通法

5.1.5琼脂糖凝胶电泳条件

5.1.6原子力显微镜条件

5.2结果和讨论

5.2.1不同多胺类金属配合物对核酸凝聚及断裂作用研究

5.2.2铜锌配合物浓度及反应温度对核酸凝聚及断裂作用的影响

5.2.3铜锌配合物对不同种类核酸凝聚及断裂作用的研究

5.2.4核酸凝聚及断裂的形态学分析

5.2.5核酸形态的凝胶电泳及原子力显微镜对照分析

5.3本章小结

参考文献

第六章结论及展望

6.1结论

6.2展望

致 谢

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摘要

人工核酸切割分子,又称人工核酸酶,是用化学方法合成的一类能模拟天然核酸酶断裂核酸骨架的功能小分子。它可以发展成为有用的分子生物学工具和基因治疗药物。本论文设计合成了一系列人工核酸断裂分子,通过多种实验手段研究了它们与核酸间的结合,断裂及凝聚作用。
   本文选用对核酸碱基具有特异性识别能力的聚酰胺体系作为修饰分子,选用具有典型水解及自由基氧化断裂机理的双苯并咪唑(IDB),单双大环多胺(Cyclen or bis-Cyclen)和抗坏血酸(Vc)为模型化合物,通过不同结构柔性手臂连接构成一系列新型核酸切割分子。旨在利用聚酰胺对核酸的特异性识别能力,提高和增强切割分子对核酸断裂的选择性及位点专一性。利用化学合成的方法对上述新型切割分子进行合成及结构表征。
   在切割分子对核酸的相互作用研究中,首先利用琼脂糖凝胶电泳方法对比研究了三类切割小分子(IDB,Bis-Cyclen and Vc)与通过聚酰胺修饰后的新型断裂试剂(Polyamide-IDB,Polyamide-Bis-Cyclenand Polyamide-Vc)对核酸断裂作用的差异。实验结果显示,聚酰胺修饰后的切割分子,在相同条件下与原始切割分子相比对核酸的断裂能力明显增加,在较低的切割浓度下,可通过双链切割有效将核酸断裂为线形DNA。这种经聚酰胺修饰提高核酸断裂能力的结果不仅适用于水解型断裂分子IDB和Cyclen,也适用于自由基氧化型断裂分子Vc。此外,利用模型分析可知,Vc对核酸具有较明显的随机性双链断裂能力,通过聚酰胺对Vc分子的修饰,将其对核酸的作用过程转变为有选择性的非随机性双链断裂。
   在人工核酸断裂分子与核酸结合能力研究中,我们先后通过圆二色光谱,核酸熔点,荧光淬灭,紫外吸收光谱及Maldi-Tof等一系列光谱及质谱方法量化分析了小分子断裂试剂在通过聚酰胺体系修饰前后对核酸亲和能力的变化。通过对比淬灭常数C50,核酸熔点差△Tm及表观结合常数Kapp等结合常数可知,聚酰胺分子的引入,使小分子切割试剂与核酸间的相互作用增强,亲和力增加,作用模式由较弱的静电吸引作用转化为较强的沟槽式结合,并显示出聚吡咯单元的聚酰胺分子对核酸中富AT序列具有明显的特异性结合作用。
   在研究中我们意外发现,含酰胺结构的多胺类分子金属配合物在一定条件下对核酸具有凝聚作用。为此,我们以双苯并咪唑(IDB),三氮九员环多胺(TACN),四氮十二员环多胺(Cyclen)为模型化合物,分别连接正丁基,正丁酰基和乙酸乙酯构成九种不同结构不同侧链的多胺类小分子配体,讨论酰胺中羰基的存在及位置对核酸凝聚的影响。首先合成并表征了上述九种配体分子及其金属配合物。
   利用琼脂糖凝胶电泳对比了多胺分子中不含羰基,含邻位羰基及间位羰基与核酸的相互作用,结果显示,只有侧链中含邻位羰基的多胺分子(即具有酰亚胺结构)在一定条件下对核酸具有凝聚作用,具有间位羰基的分子作用较弱,而含烷基侧链的多胺分子对核酸无凝聚作用。其中,金属锌配合物在一定条件下可使pUC18质粒DNA凝聚成为1000bp左右的条带,而金属铜配合物在凝聚核酸同时,对核酸进行不同程度的切割,因而凝聚成大小不同的核酸颗粒,电泳中显示为弥散条带。此外,通过浓度、温度及时间梯度对比实验证实,含邻位羰基的多胺类金属配合物对核酸的凝聚作用只发生在50℃和较高配合物浓度下,即配合物浓度与反应温度是发生凝聚作用的必要条件。选用不同种类的核酸进行实验发现,这种在一定条件下发生的凝聚作用对不同种类的核酸具有一定普遍性。
   原子力显微镜结果显示,这种凝聚作用是以带正电的小分子配合物为中心,通过静电或氢键作用,使核酸分子向内收缩,形成形态及大小相近的颗粒。

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