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低剂量纳米颗粒诱导血管内皮细胞产生ROS及其对内皮细胞连接完整性的影响

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目录

摘要

中英文略语表

第一章绪论

1.1纳米颗粒的细胞毒理学研究

1.1.1评价纳米颗粒细胞毒性的方法

1.1.2纳米颗粒细胞毒性机制

1.2纳米颗粒介导细胞ROS的研究现状

1.2.1纳米颗粒影响细胞内ROS水平的因素

1.2.2细胞内ROS变化引起的生物学效应

1.2.3 ROS变化涉及的分子信号通路

1.3纳米颗粒对血管内皮细胞的作用研究

1.4本课题的研究思路

第二章材料和方法

2.1.2试剂

2.1.3主要溶液配制

2.2主要实验耗材和仪器设备

2.2.1耗材

2.2.2仪器设备

2.3实验方法

2.3.2材料理化性质表征

2.3.3细胞培养

2.3.4细胞活性分析

2.3.6细胞铁染色方法

2.3.7细胞内活性氧检测

2.3.8细胞激光共聚焦显微镜分析方法

2.3.9抗氧化酶catalase活性检测

2.3.10 western blot

2.3.11统计学分析

第三章实验结果和讨论

3.1不同纳米颗粒的理化性质表征

3.2纳米颗粒对血管内皮细胞活性的影响

3.3血管内皮细胞对纳米颗粒的摄取

3.4纳米颗粒对血管内皮细胞ROS水平的影响

3.5纳米颗粒血管内皮细胞内过氧化氢酶(CAT)水平的影响

3.6纳米颗粒对血管内皮细胞连接及内皮层通透性的影响

3.7纳米颗粒对内皮细胞连接蛋白和细胞骨架微管蛋白表达水平的影响

3.8纳米颗粒介导的细胞间连接与细胞内ROS水平的相关性

第四章结论和展望

参考文献

附录

致谢

声明

论文说明

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摘要

目的:纳米颗粒在生物医学领域获得了广泛研究,其应用已经涉及到生物医学以及工业和日常生活的诸多方面。随着纳米颗粒暴露机会的增加,安全性问题引起政府监管部门、科学界、企业界及公众的关注。研究显示,当暴露剂量达到一定限度后,纳米颗粒会介导细胞产生活性氧自由基(Reactive Oxide Species,ROS),引起氧化应激反应,并激活下游信号通路,导致细胞凋亡。血管内皮细胞存在于富血管化的多种器官中,是营养、代谢产物以及细胞运动的“门卫”。血管内皮细胞的功能与其相互间的连接密不可分;内皮细胞的相互连接在细胞定位、增殖、凋亡以及信号传导中均发挥重要作用。纳米颗粒很容易通过呼吸或静脉暴露途径进入循环血液系统,由此获得与血管内皮细胞接触的机会。实验室前期研究发现,银纳米颗粒能够引起血管内皮细胞的ROS升高,由此导致细胞间连接蛋白VE-钙粘蛋白(VE-Cadherin)表达降低。本课题的目的是研究和比较若干常见纳米颗粒在低剂量暴露下对血管内皮细胞内活性氧以及细胞间连接的影响,探讨二者之间的关联性,为建立纳米颗粒安全性评价方法提供实验研究依据。 方法:选用化学成分、尺寸、表面修饰不同的纳米颗粒,包括:柠檬酸钠修饰的金纳米颗粒(Au-NPs)和铂纳米颗粒(Pt-NPs),Au-NPs有10nm、30nm、50nm三种粒径,Pt-NPs有5nm、30nm、70nm三种粒径;表面无修饰的二氧化硅纳米颗粒(SiO2-NPs),有20nm、50nm、100nm三种粒径;表面无修饰的两种不同晶型的二氧化钛纳米颗粒,包括锐钛矿单晶型(TiO2-NPs)、锐钛矿与金红石晶型混合相的P25-NPs,其中锐钛矿型的TiO2-NPs包括30nm、80nm、100nm三种粒径;两种不同修饰的磁性纳米颗粒,包括葡聚糖修饰的Fe2O3纳米颗粒(Dex-Fe2O3)和二巯基琥珀酸修饰的Fe2O3纳米颗粒(DMSA-Fe2O3);以及氧化多壁碳纳米管(MWCNTs)。在理化性质表征方面,采用透射电镜(TEM)观察纳米颗粒的尺寸和形貌,利用动态光散射(DLS)测定纳米颗粒的Zeta电势;在细胞研究方面,以人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)为研究对象,通过CCK-8法测定纳米颗粒暴露24h后的细胞活性;通过透射电镜观察HUVECs对不同纳米颗粒的摄取;采用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针,利用流式细胞分析术和荧光显微镜检测纳米颗粒介导的内皮细胞内ROS水平;采用过氧化氢酶(CAT)试剂盒检测纳米颗粒对细胞内抗氧化酶水平的影响;通过VE-Cadherin抗体对细胞进行荧光标记,利用激光共聚焦显微镜观察内皮细胞间连接的变化;采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理来研究细胞内ROS水平与细胞间连接之间的关系;采用Image J软件测算和分析细胞间连接的间隙宽度;应用激光共聚焦显微镜观察40-kD异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖标记内皮细胞跨单层运动;通过western blot分析经纳米颗粒暴露后内皮细胞连接蛋白和骨架微管蛋白的表达水平。 结果:(1)除MWCNTs呈管状结构外,其它几种纳米颗粒均呈颗粒状,尺寸均匀。(2)不同纳米颗粒对内皮细胞活性的影响不同,即使是相同化学组成的纳米颗粒,其尺寸和表面修饰不同,对内皮细胞的毒性也不同。在实验浓度范围内,与对照组相比,MWCNTs、Au-NPs、Dex-Fe2O3对血管内皮细胞的毒性较低,Pt-NPs、SiO2-NPs、TiO2-NPs、P25-NPs、DMSA-Fe2O3的细胞毒性均表现出明显的浓度依赖性,随着实验浓度的增加,细胞毒性增强。(3)纳米颗粒能被内皮细胞摄取,在细胞毒性低于一级的低剂量暴露条件下,纳米颗粒均会诱导细胞内ROS产生,同时引起细胞内过氧化氢酶活性上调,导致VE-Cadherin表达降低和微管蛋白乙酰化下调,这些影响最终导致内皮细胞间隙形成。(4)抗氧化剂NAC处理可降低纳米颗粒引起的胞内ROS水平上调,细胞间连接蛋白表达趋于正常。 结论:低剂量暴露的纳米颗粒能引起细胞内ROS的上调和过氧化氢酶活性增强,导致内皮细胞间连接蛋白VE-Cadherin下调,血管内皮细胞间隙增大,内皮层通透性增加。提示在评价纳米颗粒体内应用的安全性时,除采用常规方法检测其对细胞活性的影响外,还应考虑评价其对血管内皮细胞内活性氧水平及细胞间连接的作用。

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