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分离纯化的脂肪干细胞(CD34+CD31-)成软骨分化能力的初步研究

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摘要

前言

第一部分 脂肪干细胞的分离纯化与鉴定

一、材料

二、实验方法

三、结果

四、讨论

五、小结

第二部分 二维条件下hASCs(CD34+CD31-)的成软骨潜能的鉴定

一、主要材料

二、实验方法

三、结果

四、讨论

五、小结

第三部分 三维条件下hASCs(CD34+CD31-)的成软骨潜能的鉴定

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

五、小结

六、本研究局限性及今后的研究方向

结论

参考文献

文献综述 脂肪干细胞表面标志物的研究进展

英文缩略词表

致谢

声明

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摘要

种子细胞来源是限制软骨组织工程应用于临床的关键问题。脂肪间充质干细胞(Adipose-derived stem cells，ASCs)来源丰富，取材容易，体外倍增速度快，免疫原性低，有望成为组织工程与再生医学的理想种子细胞来源。然而脂肪组织经酶消化后，得到的是基质血管部分（Stromal vascular fraction，SVF），其中具有多向分化潜能的干细胞所占的比例较小，成软骨能力较弱，需要对其进行分离纯化，提高ASCs的比例。新鲜分离的干细胞中高表达CD34，通过流式分选技术，采用CD34和CD31这两个标志物对SVF进行流式细胞分选(CD34+CD31-)，并将分离纯化的ASCs用于组织工程化软骨的构建，为优化软骨组织工程种子细胞提供理论依据。
　　目的：从脂肪组织中分离纯化CD34+CD31-细胞亚群，比较CD34+CD31-细胞亚群与未分选细胞的表面标志，证实流式细胞分选CD34+CD31-细胞是分离纯化ASCs的有效方法，并对CD34+CD31-细胞亚群与SVF进行成软骨相关检测，验证CD34+CD31-细胞亚群的成软骨潜能。
　　1、脂肪干细胞的分离纯化与表面标志鉴定
　　方法:将脂肪抽吸术得到的脂肪组织经胶原酶消化得到新鲜分离的SVF，对其进行流式细胞分选，分选出CD34+CD31-的细胞亚群，即人脂肪干细胞(Humanadipose-derived stem cells，hASCs)，对hASCs(CD34+CD31-)和未分选细胞(SVF)的进行干细胞表面标志物的流式分析。
　　结果:新鲜分离的SVF中CD34表达率约为88.37％。采用CD34和CD31(CD34+CD31-)对新鲜分离的SVF进行分选，CD34+CD31-亚群约占66.74％且随年龄增大，比例有所升高。CD34+CD31-亚群表面CD44、CD90、CD73均呈阳性表达，且明显高于SVF，CD45、CD105均为阴性表达。
　　2、二维培养条件下验证hASCs(CD34+CD31)的成软骨潜能
　　方法:将分选出的hASCs(CD34+CD31-)和SVF分别在二维（单层培养）条件下进行成软骨诱导，通过Real-time PCR检测成软骨相关基因Aggrecan和Ⅱ型胶原及软骨肥大基因X型胶原的表达，甲苯胺蓝和免疫组化染色对软骨基质及Ⅱ型胶原进行半定量检测，比较hASCs(CD34+CD31-)和未分选细胞的成软骨潜能。
　　结果:hASCs(CD34+CD31-)和SVF在成软骨诱导14天后，Aggrecan、Ⅱ型胶原及X型胶原表达量均上调，两者相对表达量无差异，甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原染色均为阳性，二者积分光密度无统计学差异。
　　3、三维培养条件下验证hASCs(CD34+CD31-)的成软骨潜能
　　方法:将分选出的hASCs(CD34+CD31-)和SVF分别在三维(pellet)条件下进行成软骨诱导，进行大体观察、HE、甲苯胺蓝、番红O及免疫组化染色，并检测GAG含量，比较hASCs(CD34+CD31-)和未分选细胞的成软骨潜能。
　　结果:hASCs(CD34+CD31-)组在三维条件下成软骨诱导28天后，形成的pellet较SVF组更接近软骨组织形态，甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原染色均为阳性，积分光密度均高于SVF组，GAG含量两组无统计学差异。
　　结论：1、新鲜分离的SVF中高表达CD34，年龄因素不影响SVF中CD34的表达。与SVF相比，采用流式分选得到的CD34+CD31-亚群高表达干细胞表面标志物，因而认为通过流式分选可成功分离纯化hASCs。CD34+CD31-亚群比例随年龄增长有升高趋势。
　　2、在二维培养条件下，hASCs(CD34+CD31-)与SVF均能被成功诱导向软骨方向分化，而二者在成软骨相关基因的表达，及软骨基质的合成方面并无明显差异。
　　3、在体外三维培养条件下，hASCs(CD34+CD31-)可被诱导向软骨方向分化，其大体观及组织学染色半定量检测均优于SVF，可初步认为hASCs(CD34+CD31-)在体外的成软骨能力优于SVF。

著录项

  • 作者

    赵小晖;

  • 作者单位

    北京协和医学院;

    中国医学科学院;

    清华大学医学部;

    北京协和医学院中国医学科学院;

  • 授予单位 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院;
  • 学科 整形外科学
  • 授予学位 博士
  • 导师姓名 滕利;
  • 年度 2016
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 R329.25;
  • 关键词

    软骨组织; 种子细胞; 脂肪间充质干细胞; 分离纯化工艺; 成软骨分化;

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