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脂质组学分析技术的研究及其在与疾病相关潜在生物标志物和中药作用机制研究中的应用

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摘要

第一章 脂质组学研究和基于代谢组学的中药研究策略进展

第一节 脂质组学研究进展

摘要

前言

一、脂质化合物的结构及分类

二、脂质化合物的生物学功能及其代谢异常与疾病的关系

三、脂质组学分析技术

四、小结

第二节 基于代谢组学的中药研究策略

摘要

前言

一、代谢组学研究法

二、中药血清药物化学及中医方证代谢组学研究法

三、网络药理学研究法

四、小结

参考文献

第二章 皮肤角质层鞘脂组学分析方法研究及其在与疾病、年龄相关潜在生物标志物研究中的应用

第一节 皮肤角质层鞘脂组学分析方法研究

一、仪器设备与实验材料

二、实验方法

三、实验结果与讨论

四、结论

第二节 儿童特应性皮炎患者皮肤角质层鞘脂表征及与疾病相关潜在生物标志物的研究

一、实验设备与实验材料

二、实验方法

三、实验结果与讨论

四、结论

第三节 不同年龄人群皮肤角质层鞘脂表征及与年龄相关潜在生物标志物的研究

一、实验设备与实验材料

二、实验方法

三、实验结果与讨论

四、结论

参考文献

第三章 基于脂质组学中药复方小续命汤治疗脑缺血作用机制和物质基础的探索研究

第一节 脂质组学分析平台的构建

一、仪器设备与实验材料

二、实验方法

三、实验结果及讨论

四、结论

第二节 复方小续命汤治疗大鼠慢性脑缺血的药效评价

一、仪器设备与实验材料

二、实验方法

三、实验结果及讨论

四、结论

第三节 基于脂质组学复方小续命汤治疗脑缺血作用机制和物质基础的探索研究

一、仪器设备与实验材料

二、实验方法

三、实验结果及讨论

四、结论

参考文献

第四章 天山雪莲中鞘脂类化合物及其他成分的分析和鉴定

一、仪器设备与实验材料

二、实验方法

三、实验结果及讨论

四、结论

参考文献

英文缩略词

致谢

个人简历

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摘要

脂质组学作为代谢组学的一个重要分支越来越得到人们的关注。随着分析技术的进步，针对脂质化合物的分析技术不断完善和提高，脂质类化合物能够更好、更全面的被表征、鉴定及定量分析。基于脂质组学分析技术揭示脂质代谢异常与疾病的相关性，寻找潜在生物标志物是目前研究的热点。本论文针对脂质组学开展其分析技术的研究，并将所建立的分析技术应用于与疾病相关潜在生物标志物及中药作用机制和作用物质基础的研究。
　　本论文研究建立了靶向皮肤角质层鞘脂组学分析方法，采用正相高效液相色谱联用三重四极杆质谱分析技术，基于皮肤角质层中鞘脂类化合物的结构相关色谱和质谱特点，靶向表征皮肤角质层中的鞘脂类化合物并同时进行含量测定。所建立的前处理方法简单易行:将皮肤角质层样本收集于含内标的甲醇溶液中，涡旋、超声提取并氮气吹干，复溶后即可进样分析。色谱分离采用正相高效液相色谱法，可对皮肤角质层中的鞘脂类化合物按照亚类进行分离，能够实现未知鞘脂化合物的推测及鉴定。质谱采用APCI源，动态多反应监测（dynamic multiple reaction monitoring，dMRM）模式。APCI源在正相溶剂条件下对鞘脂类化合物有很好的响应，能够保证检测灵敏度。DMRM模式能够满足短时间内同时测定大量化合物的要求。所建立的方法可在单次运行时间20 min内测定分析483个鞘脂类化合物。这些化合物涵盖了角质层神经酰胺的所有12个亚类，且包含了之前未见文献报道的糖基化神经酰胺。可获取标准品的各个亚类均有代表性的标准品，被测化合物可根据结构类似的标准品进行含量测定。对所建立方法进行了方法验证:线性范围为50-2000pmol/mL，r值均大于0.99;定量限(LOQ)为5-20 pmol/mL，检测限(LOD)为2-10 pmol/mL;各标准化合物的回收率在83-117％之间;仪器精密度RSD均小于13.1％，且准确度在81-112％之间;稳定性数据表明QC样本在冰箱4℃放置3天稳定;3个浓度的基质效应均在97-119％之间。将所建立的方法应用于健康儿童及患儿童特应性皮炎(AD)儿童的皮肤角质层样本，发现了表征疾病与健康状态差异的潜在生物标志物48个，涵盖Cer[ADS]（2个）、Cer[AH]（1个）、Cer[AS]（15个）、Cer[NH]（4个）、Cer[NS]（18个）、Cer[NDS]（4个）和Cer[NP]（4个）7个亚类。将所建立的方法应用于不同年龄组的人类角质层样本，发现了能够表征成人与儿童年龄差异的潜在生物标志物193个，涵盖了13个类别（12个神经酰胺亚类及糖基化神经酰胺），其中Cer[ADS]类12个，Cer[AH]类47个，Cer[AP]类13个，Cer[AS]类33个，Cer[EODS]类4个，Cer[EOH]类12个，Cer[EOP]类4个，Cer[EOS]类19个，Cer[NDS]类17个，Cer[NH]类6个，Cer[NP]类20个，Cer[NS]类1个，糖基化神经酰胺5个。本研究首次对儿童皮肤角质层样本进行了测定，为评价皮肤疾病与健康状态屏障功能的差异提供了新的科学数据。此外，本研究还揭示了皮肤角质层鞘脂类化合物在不同年龄中的分布特点。
　　本论文优化了实验室已有的靶向鞘脂组学分析方法，使鞘脂类化合物的分析通量由47个增加至86个;并与实验室已有的其他脂质化合物（甘油酯、甘油磷脂和高丰度鞘脂）分析方法相结合，构建了脂质组学分析技术平台。优化后的靶向鞘脂组学分析方法采用高效液相色谱串联三重四极杆质谱分析。色谱柱为Peeke C8 SR柱(150×3.0 mm，3μm)，流动相为0.1％甲酸水（含1 mmol/L甲酸铵）-甲醇（含0.1％甲酸，1 mmol/L甲酸铵）以0.5 mL/min的流速梯度洗脱。质谱检测模式为MRM模式，并采用分段(segments)的方式增加被测化合物数目，提高检测灵敏度。基于构建的脂质组学分析平台，研究中药复方小续命汤(XXMD)治疗慢性脑缺血(CCI)的作用，从脂代谢网络的角度揭示XMD对CCI的作用物质基础和治疗作用机制。研究使用双侧颈总动脉永久性结扎法(2VO)建立慢性脑缺血大鼠模型，将大鼠分为假手术、模型以及模型给药三组，模型给药组持续灌胃给予XXMD0.15 g/kg一个月后，进行药效学评价:Morris水迷宫法检测大鼠的学习记忆能力;超氧化物歧化酶活度(SOD)、丙二醛含量(MDA)等生化指标的测定表征氧化损伤;Nissls染色观察海马CA1区及大脑皮层神经元结构;KB染色观察脑白质变化。实验结果表明造模成功且给药有效。采用靶向脂质组学分析平台表征了靶器官脑和血浆中脂质化合物的轮廓变化，发现造模后显著变化的脂质类化合物以及给药XXMD对脂质代谢的显著调节作用。造模后脑组织中9类89个、血浆中8类53个脂质发生显著变化;给药XXMD后脑组织中11类116个、血浆中12类113个脂质代谢显著改善。采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)进行多元统计分析，在血浆及脑组织中均发现了表征CCI模型损伤，以及XXMD通过影响脂代谢改善脑损伤的潜在生物标志物。在脑组织中表征造模损伤的生物标志物有8类52个，血浆中有7类38个;脑组织中表征XXMD治疗作用的脂质有10类100个，血浆中有10类73个。本研究还采用色谱高分辨分析技术结合质谱树状图过滤技术(MTSF)进行XXMD给药后模型给药组大鼠血浆及脑组织中的代谢产物发现和鉴定。在血浆中鉴定了28种原型及代谢产物，其中6种为原药液成分，22种为代谢产物;脑组织中鉴定了2种原型及代谢产物，1种为原药液成分，1种为代谢产物。采用Person相关性分析计算代谢物峰面积数据与潜在脂质生物标志物含量数据之间随时间点变化的相关性，发现显著相关的化合物对。脑组织中鉴定得到的2种代谢产物均能找到对应相关的脂质化合物，共9对;血浆中所鉴定出的28种代谢产物有17种具有对应相关的脂质化合物，共95对。该分析从脂代谢网络的角度揭示XXMD对CCI的作用物质基础和治疗作用机制。本研究创新性地基于脂质组学研究XXMD治疗脑缺血的作用机理和作用物质基础，为中药复方物质基础、药效评价和作用机制的深入诠释提供了有价值的研究思路和技术手段。
　　天山雪莲（Saussurea involucrata(Kar.et Kir.) Sch.-Bip)是新疆的名贵中药材，文献报道其含有鞘脂类化合物，具有抗癌和护肤作用。本论文基于已建立的脂质分析平台，建立了天山雪莲鞘脂化合物的HPLC-LTQ/FTICRMSn定性分析方法，用于靶向鉴定天山雪莲中特有的的鞘脂类化合物。前处理采用75％乙醇对药材粉末进行提取。为了获得低丰度鞘脂类化合物的质谱数据，采用硅胶柱色谱进行分离富集，以不同比例的氯仿-甲醇洗脱并收集各洗脱流份，蒸干、复溶后进样分析。色谱柱为Spectra C8 SR柱(150×3.0 mm，3μm)，流动相为乙腈-异丙醇（5∶2，体积比）和0.1％乙酸水（含2 mmol/L乙酸铵）以0.2 mL/min流速梯度洗脱。质谱采用FTICRMS采集数据。一级质谱采用全扫描模式获得高分辨质谱数据，分辨率为50000。多级质谱数据采用数据依赖型扫描模式获得，对丰度最强的两个离子采集MS2质谱数据，并对MS2离子中丰度最强的一个离子采集MS3质谱数据。通过对鞘脂类化合物标准品裂解规律的总结推测未知鞘脂类化合物的裂解规律并对其进行鉴定。本研究还建立了HPLC-LTQ/FTICRMSn分析方法鉴定天山雪莲中的多种其他化学成分（黄酮类及苯丙素类）。前处理采用75％乙醇对药材粉末进行提取。为了获得低丰度鞘脂类化合物的质谱数据，采用ODS柱色谱进行分离富集，以不同比例的甲醇-水洗脱并收集各洗脱流份，蒸干、复溶后进样分析。色谱柱为Thermo Accucore C18色谱柱(4.6×100 mm，2.6μm)，流动相为乙腈、0.2％乙酸水溶液（含10 mmol/L乙酸铵）以流速1.0 mL/min梯度洗脱。质谱采用FTICRMS采集数据。一级质谱采用全扫描模式获得高分辨质谱数据，分辨率为50000。多级质谱数据采用数据依赖型扫描模式获得，对丰度最强的两个离子采集MS2质谱数据，并对MS2离子中丰度最强的一个离子采集MS3质谱数据。数据后处理结合质谱树状图过滤技术(MTSF)进行。通过前处理技术与数据后处理技术的结合，共鉴定出了天山雪莲中的38个化合物，含黄酮类化合物19个，苯丙素类化合物11个，鞘脂类化合物8个;其中有7个黄酮类、8个苯丙素类、8个鞘脂类化合物为首次鉴定。本研究为天山雪莲的深入研究和开发提供了科学依据。同时我们探索了前处理富集中药材中微量成分，结合色谱高分辨质谱技术以及数据后处理技术，快速分析和鉴定中药材成分的策略，为中药材成分快速分析提供了有价值的技术方案。

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