盐敏感高血压干预新靶标的探索性研究

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第一部分:血管内皮LncRNA NOS3AS的上调参与盐敏感高血压的发生
　　目的:高血压是环境、遗传因素及表观遗传调控相互作用引起的复杂性状疾病。盐作为重要的环境因素之一，一直是人们关注的焦点。近百年来人们围绕盐与血压关系进行的研究，基本上确定了盐是高血压最重要的易患因素。但在人群内个体间对盐负荷或限盐却呈现不同的血压反应，即存在盐敏感性问题。盐敏感性是连接盐与高血压的遗传基础，是原发性高血压的一种内表型。研究者们用不同的方法探索导致盐敏感性的易感基因，以期阐明盐敏感性高血压的分子遗传学发病机制。表观遗传控制机制是保证基因的表达可以精确地应对来自机体内外部环境的变化的基础。所以表观遗传学可能是连接环境因素与基因型的桥梁。表观遗传学为我们解释环境因素如何影响个体的基因背景进而产生变异而诱发疾病提供一种可能。虽然已有多个与盐敏感高血压相关的表观遗传调控机制被发现，但基于RNA的表观修饰还未见报道，尤其是已在在心血管疾病中显示出重要的调控功能的长链非编码RNAs(LncRNAs)。研究发现LncRNAs在心血管表观遗传中亦起着重要作用。虽然尚没有LncRNAs与盐敏感高血压直接相关的证据，但是从LncRNAs所调控的靶基因的生物学功能分析提示可能有LncRNAs参与了盐敏感高血压的发生并在其中发挥调控作用。本研究采用候选策略，选取了其所调控的编码基因直接与盐敏感高血压相关的以下三个LncRNA——HOTAIR、NOS3AS、aHIF，拟从体内（盐敏感高血压动物模型）、体外（人肾小管上皮细胞和人脐静脉内皮细胞）两个水平验证可能参与盐敏感高血压发生的LncRNA。
　　方法:我们选用边缘高血压大鼠(borderline hypertensive rat, BHR)作为本研究的动物模型，它是自发性高血压大鼠(spontaneously hypertension rat, SHR)与血压正常的Wistar-Kyoto大鼠(WKY)杂交后的F1代，是一种环境因素诱导的高血压模型，并且鉴于SHR母鼠与WKY母鼠的子代对于环境因素敏感性的不同，我们选用较敏感的SHR母鼠的子代sBHR。5周龄体重、血压相当的sBHR随机分为雌雄各4只的4个实验组:高盐饮食组(high salt diet)、高盐饮食后枸杞干预组(Lycium barbarum L)、正常饮食组(control)、低盐饮食组(low salt diet)。正常饮食4周后（9周龄）给予不同盐浓度纯成分饲料，尾脉搏测压法观察高血压发生情况。待高盐饮食诱导血压升高一周后给予高盐饮食后枸杞干预组具有补肾益精的枸杞（雌鼠10g/天，雄鼠20g/天）4周，以观察饮食能否干预高盐诱导的血压水平，尾脉搏测压法监测血压水平。实验结束后磁珠法分选sBHR肾小管上皮细胞和肾血管内皮细胞，实时荧光定量PCR法(Real-time qPCR)检测三个LncRNA(HOTAIR、NOS3AS、aHIF)和受其调控的编码基因(LSD1、eNOS、HIF-1α)的表达。体外实验我们选择人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人肾小管细胞(HKC)验证高盐负荷下三个LncRNA(HOTAIR、NOS3AS、aHIF)和受其调控的编码基因(LSD1、eNOS、HIF-1α)的表达。
　　结果:给予9周龄的sBHR不同盐浓度纯成分饲料后，高盐饮食12周后，高盐组(high salt diet)和高盐饮食后枸杞干预组(Lycium barbarum L)的血压较正常饮食组明显升高。随后给予高盐饮食后枸杞干预组(Lycium barbarum L)每天20g（雄鼠）/10g（雌鼠）的枸杞，四周后高盐饮食后枸杞干预组(Lycium barbarumL)的血压降至正常水平。但低盐饮食组(low salt diet)的血压水平与正常饮食组(control)的差异没有统计学意义。Real-time qPCR检测磁珠法分选的各组sBHR肾血管内皮细胞LncRNA NOS3AS和编码基因eNOS的表达，结果显示:相对于正常饮食的血压正常组，高盐饮食诱导的高血压组的LncRNA NOS3AS的表达明显上调，但是eNOS的表达却没有变化，表现为血压升高。而高盐饮食后枸杞干预组(Lycium barbarum L)相对于高盐饮食组(high salt diet) LncRNANOS3AS的表达明显降低，并伴eNOS表达的显著上调，表现血压下降。低盐饮食组(low salt diet) LncRNA NOS3AS和eNOS的表达与正常饮食组（control）相比没有差异，血压水平也没有明显的差别。在高盐负荷(150 mM NaCl)刺激下1小时后，HUVEC细胞LncRNA NOS3AS呈一过性地表达上调，而受其转录后调控的编码基因eNOS在高盐负荷刺激6小时后表达有明显的下调。并且在高盐负荷一小时时，加入枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides，LBP)的HUVEC所表达的LncRNA NOS3AS明显低于未加入LBP的HUVEC。而本研究所涉及的另外两种LncRNA（HOTAIR和aHIF）与高盐负荷及盐敏感高血压的发生没有明显的相关性。
　　结论:我们的研究结果显示LncRNA NOS3AS通过下调eNOS mRNA的表达而参与盐敏感高血压的发生。本研究从体内（盐敏感高血压模型）和体外（人脐静脉内皮细胞）两个水平均证实了高盐负荷可诱导LncRNA NOS3AS的表达显著上调。同时eNOS mRNA的表达水平随着LncRNA NOS3AS的上调而下降，随着LncRNA NOS3AS的抑制而上升。而且上调的LncRNA NOS3AS与高盐饮食诱导的血压升高密切相关。并且在高盐负荷下，不论体内试验的sBHR肾血管内皮细胞还是体外实验的人脐静脉内皮细胞的LncRNA NOS3AS的上调始终早于eNOS mRNA水平的下调。提示我们LncRNA NOS3AS不论是在对高盐负荷刺激的应答方面还是反应血压水平方面，都比eNOS mRNA的表达更具敏感性。
　　第二部分:紫草化腐汤通过TLR2及TLR4途径诱导巨噬细胞极化为M2b/c调节型巨噬细胞
　　目的:紫草化腐汤，由紫草等十九味中药组成，全方共奏去瘀活血、化腐生肌、祛风解毒、消肿止痛、燥湿敛疮、煨脓长肉之功，在临床上外用于各类创伤感染性创面和难愈性溃疡。而现代医学认为，慢性难愈合性创面的主要特征为持续异常的炎症反应，包括单核/巨噬细胞的持续激活和聚集，以及一系列促炎炎症因子表达的异常升高。因此，紫草化腐汤的药理作用显示出其具有强大的免疫调节功效。虽然现代中药药理学研究已阐明了紫草的抗菌、消炎以及抗肿瘤等药效的分子机制，已明确紫草对多种细菌有明显的抑制作用，且可加强局部血液循环，促进上皮生长，从而起到抗感染、生肌祛腐的功效。但是整个方剂的药理机制并没有被阐明。巨噬细胞是一种具有可塑性和多功能性的细胞群体，通过模式识别受体(TLRs)控制着机体免疫应答，并保持促炎反应和抑炎反应的平衡。因此我们提出假设:紫草化腐汤可通过影响巨噬细胞极化类型的信号转导通路影响其极化方向，从而发挥其消炎止痛、去腐生肌的免疫调节作用。
　　方法:我们利用体外培养的THP-1细胞来研究紫草化腐汤对于单核/巨噬系统的影响。首先使用ELISA实验检测在不同浓度的紫草化腐汤(1％，2％及3％(v/v))的作用下，不同时间点，包括TNF-α、TGF-β1、IL-6、IL-8和CCL2在内的几种已经成为治疗各类炎症相关性疾病的干预靶点的细胞因子的分泌情况。接着我们利用real-time qPCR的方法检测了巨噬细胞类型相关的特征性细胞因子的基因表达水平以判断紫草化腐汤诱导巨噬细胞极化的方向。继而检测了参与该过程的TLRs，并且利用有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPKs)抑制剂验证了参与紫草化腐汤诱导巨噬细胞极化的信号转导途径。
　　结果:紫草化腐汤并不是单纯地抑制M1型巨噬细胞分泌的传统意义上的促炎因子，而是表现出类似于GM-CSF诱导的M2型巨噬细胞的特性:获得了产生TNF-α的能力并且可以低水平的表达IL-6。THP-1细胞在紫草化腐汤的作用下激活TLR4和TLR2途径诱导巨噬细胞极化为M2b/c调节型巨噬细胞，在高表达IL-10的同时低表达IL-12。但是介导这种极化现象的转录途径却是复杂的:IL-8基因的表达经紫草化腐汤诱导后显著增加，并且阻断三种MAPKs中的任何一种激酶都可以抵消紫草化腐汤相关的表达增加，说明紫草化腐汤对IL-8表达的影响是多途径多通路的。但同时，紫草化腐汤却只通过JNK1/2和p38 MAPK两种途径促进TGF-β2的表达。
　　结论:综上所述，我们的研究发现，紫草化腐汤能够直接诱导巨噬细胞极化为M2b/c调节型巨噬细胞而发挥其消炎止痛、去腐生肌的药理作用，实现了抑制炎症反应、促进坏死的组织细胞的清除、促进血管生成和促进组织愈合。而这个过程是通过上调TLR2和TLR4并激活MAPKs的活性特异性的高表达IL-10、IL-8、CCL2、TGF-β2，同时低表达IL-12、IL-6、TNF-α和TGF-β1而实现的。我们的研究不仅提供了一个基于巨噬细胞极化方向的对抗慢性炎症性相关疾病的干预靶点，更为我们理解和解释众多消炎止痛类的传统中药的药理机制提供了新的切入点。
　　第三部分:中国人群脑卒中预后的“肥胖悖论”
　　目的:超重和肥胖是多种心血管系统疾病，包括脑卒中、高血压病、冠心病和心力衰竭的重要危险因素之一。因此，在心血管系统疾病的一级预防中，控制超重和肥胖是一项重要措施。然而近年的一些研究，尤其是心血管疾病方面的队列研究，却发现体质指数(body mass index，BMI)与患者近期和远期死亡率呈反比，此即所谓的“肥胖悖论”。与其他心血管疾病一样，对于脑卒中的患者来说，控制体重仍是预防脑卒中发生和复发的重要措施，但是与低体重和正常体重患者相比，超重和肥胖的脑卒中患者却拥有较低的死亡率。
　　虽然“肥胖悖论”的证据越来越多，但还是受到了质疑。首先，“肥胖悖论”只是一种统计学的相关，目前还不能肯定其间存在因果联系;其次，对肥胖的定义产生偏差。大部分关于“肥胖悖论”的研究，都以WHO推荐的BMI标准作为划定肥胖的标准，而很少测量患者的腰围(WC)、臀围。事实上，研究发现，不同人种的体脂分布不同，应根据不同人种选取相应的BMI截点定义肥胖。并且相比反映身体整体肥胖程度的指标的BMI，反映中心性肥胖的指标，WC、腰臀比(waist to hip ratio，WHR)，体重升高比等指标具有更好的预测力。
　　面对脑卒中居高不下的致死率和致残率，影响其复发和预后的危险因素仍值得进一步深入地探索和研究，特别是仍然具有争议的“肥胖悖论”提示我们，过度的减肥治疗是否应该慎而为之？本研究针对其他关于脑卒中预后与肥胖相关性分析的研究的缺陷，不仅考虑了人群种族的问题，除应用经典连续变量的四分位法划分BMI区间外，还采用了以BMI作为划定肥胖的中国标准，而且增加了在对于肥胖与心血管疾病风险的研究上具有更好的预测力的WHR这一指标，多角度应证中国人群中脑卒中预后的“肥胖悖论”。
　　方法:我们对国家科技部973项目关于脑卒中危险因素的多中心分析研究的数据库进行了再评估。本研究中的所有脑卒中患者同时招募于兖州、西安、重庆、武汉、北京和天津七个临床中心2000-2001年间的住院患者。试验纳入的脑卒中患者只包括以下三种类型:血栓性脑梗死(thrombosis)，腔隙性脑梗死(lacunar)，脑出血(hemorrhage)。相关诊断必须符合第九版《国际疾病分类》制订的各类脑血管病诊断标准，且经头颅CT和/或MRI证实有梗死灶者——CT(89.8％)，MRI(5％)，或者两者兼有(5.2％)。在所有被招募的2000例脑卒中患者中，177例患者由于以下诸种原因而最终被排除:缺失明确的诊断（24例），缺失血浆(76例)，基因分型不明确（77例）。最终分析的样本大小为1823例，其中807例为血栓性脑梗死(thrombosis)，513例为腔隙性脑梗死(lacunar)，503例为脑出血(hemorrhage)。1823例脑卒中患者按BMI的四分位分类法分为四组:Q1，BMI＜21.9kg/m2; Q2,21.9≤BMI＜24.2 kg/m2; Q3,24.2≤BMI＜26.4 kg/m2; Q4,BMI≥26.4kg/m2。再根据中国肥胖工作组对我国成人超重、肥胖及中心性肥胖分类的建议，分别以BMI≥24定为超重，BMI≥28定为肥胖，WHR值男性≥0.9，女性≥0.85，称为中心性肥胖。根据以上标准，所有纳入试验的脑卒中患者按BMI分为低体重组(BMI＜18.5 kg/m2)正常体重组(18.5≤BMI＜24 kg/m2)、超重组（24.0≤BMI＜28kg/m2）和肥胖组(BMI≥28.0 kg/m2);按WHR分为正常组（男性WHR＜0.90，女性WHR＜0.85）和中心性肥胖组(男性WHR≥0.90，女性WHR≥0.85)。以患者入组时间为起点，死亡发生时间为终点。风险比(hazard ratios，HR)以及95％可信区间(95％ confidence intervals，CI)通过单因素及多因素Cox回归模型进行计算。并对不同脑卒中类型进行分层评估。所有统计分析均通过SPSS14.1版SPSS软件实施，以p＜0.05表示差异有统计学意义。
　　结果:最终分析的样本大小为1823例，患者年平均60.3±9.4岁，其中男性占63.5％。1823例脑卒中患者按BMI的四分位分类法分为四组:Q1～Q4，BMI在Q3组（24.2≤BMI＜26.4 kg/m2）的脑卒中发作后的患者，其全死因死亡风险最低(HR:0.77，CI:0.66-0.90，p=0.001)，其BMI与全死因死亡风险之间，呈U型曲线。同时经过亚组分析后发现，BMI在此范围的血栓性脑梗死患者，其全因死亡风险(HR:0.70，95％ CI:0.55-0.89，p=0.003)和心血管事件相关死亡风险(HR:0.67，95％ CI:0.47-0.95，p=0.023)均为最低。随后我们就按照中国肥胖工作组对我国成人超重、肥胖分类的建议，分别以BMI≥24定为超重，BMI≥28定为肥胖。结果显示，在校正了所有混杂因素后，相对于体重正常组，超重组(HR:0.75;95％CI:0.58-0.96，p=0.021)的全因死亡风险降低。而低体重组(HR:1.70;95％ CI:1.09-2.65，p=0.02)的全因死亡风险增加。在经过亚组分析后发现体重超重组的血栓性脑梗死患者，无论是其全因死亡风险(HR:0.65;95％ CI:0.45-0.93，p=0.020)还是心血管事件相关的死亡风险(HR:0.56;95％ CI:0.32-0.98，p=0.042)均降低。而对于腔隙性脑梗死患者来说，其低体重组的全因死亡风险(HR:6.11;95％CI:1.65-22.60，p=0.007)和心血管事件相关的死亡风险(HR:9.91;95％ CI:1.59-61.62，p=0.014)明显增加。本研究又进一步采用了中国肥胖工作组对我国成人中心性肥胖分类的建议，分别以WHR值男性≥0.9，女性≥0.85定义中心性肥胖。根据以上标准，中心性肥胖的脑卒中患者，无论是其全因死亡风险(HR:0.73;95％ CI:0.58-0.91，p=0.006)还是心血管事件相关的死亡风险(HR:0.65;95％CI:0.48-0.89，p=0.008)相对于正常组都是降低的。其中中心性肥胖的血栓性脑梗死患者的全因死亡风险低于正常组(HR:0.71;95％ CI:0.51-0.98，p=0.040)，而中心性肥胖的腔隙性脑梗死(HR:0.45;95％ CI:0.22-0.94，p=0.032)和脑出血的患者(HR:0.59;95％ CI:0.36-0.98，p=0.039)的心血管事件相关的死亡风险低于正常组。
　　结论:综合我们的研究结果可以发现，中国人群的脑卒中预后同样存在着“肥胖悖论”，即减轻体重、防治肥胖虽可以减少脑卒中的发生，但是体重下降后脑卒中患者的预后却得不到改善，甚至反而更差。尤其相对于体重正常的脑卒中患者，体重超重/中心性肥胖的患者的全因死亡风险更低。

著录项

作者
张馨予;
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作者单位

北京协和医学院;

中国医学科学院;

清华大学医学部;

北京协和医学院中国医学科学院;

展开▼
授予单位北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院;
学科生物化学与分子生物学
授予学位博士
导师姓名惠汝太;
年度 2013
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正文语种中文
中图分类高血压;
关键词
盐敏感高血压; 血管内皮生长因子; 分子遗传学; 靶向治疗; 发病机制;

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