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构建同种异体组织工程骨及修复大动物骨缺损的实验研究

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摘要

目的：
　　 同种异体骨髓间充质干细胞(allogeneic bone mesenchymal stem cells，allo-BMSCs)体内移植后是否完全免疫豁免和发挥生物学作用，目前还存在争议。本实验应用allo-BMSCs复合生物材料构建组织工程骨(tissue-engineered bone，TEB)并植入比格犬皮下，研究同种异体TEB(allo-TEB)异位移植后的成骨能力，并检测受体的免疫反应。同时建立比格犬下颌骨标准骨缺损模型，探索应用allo-TEB修复下颌骨缺损的可行性并检测修复过程中受体的免疫反应。
　　 方法：
　　 (1)体外分离培养比格犬BMSCs，向成骨、成软骨和成脂方向诱导分化并鉴定。应用电镜扫描观察BMSCs在珊瑚支架材料上的生长。
　　 (2)裸鼠体内应用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CM-Dil标记比格犬BMSC进行示踪研究。MTT法检测BMSCs标记后的增殖能力。标记BMSC复合珊瑚支架植入裸鼠体内，术后4、8和12周取材，通过免疫组织化学和荧光显微镜观察的方法示踪植入体内的BMSC，并通过组织学观察标记细胞-珊瑚支架复合物的异位成骨能力。
　　 (3)实验分组：应用PCR的方法分析比格犬MHCI类基因的不同，并结合混合淋巴细胞培养(MLC)对犬不同个体基因错配进行实验分组。
　　 (4)同种异体比格犬BMSCs体内异位构建TEB：比格犬BMSCs分别复合珊瑚和β-TCP支架材料后体外成骨诱导培养1周，植入自体、异体比格犬皮下，空白材料植入作为阴性对照。术后3、7、14、28和56天通过组织学评价allo-TEB的成骨能力，并检测犬外周血白介素的含量。
　　 (5)同种异体比格犬BMSCs体内原位构建TEB修复骨缺损：建立比格犬右侧下颌骨标准全层骨缺损模型(长度为3cm)，应用构建的自体、异体BMSC-支架复合物原位移植修复缺损，空白材料植入作为阴性对照，自体骨移植作为阳性对照。术后24周通过影像学、大体观察、生物力学和组织学评价下颌骨缺损的修复质量，并于3、7、14、28和56天检测犬外周血免疫相关细胞因子的含量以及淋巴细胞分型。
　　 结果：
　　 (1)BMSCs培养和复合支架：比格犬骨髓中分离出的BMSCs能够向骨、软骨和脂肪方向分化，复合珊瑚支架可在三维环境中黏附生长、增殖并分泌细胞外基质。
　　 (2)标记BMSCs:EGFP和CM-Dil标记的BMSCs体外增殖能力与未标记BMSCs比较无显著性差异（P＞0.05）。植入裸鼠体内12周后，EGFP标记的BMSCs仍表达GFP蛋白，CM-Dil标记的BMSCs在TEB中仍能激发红色荧光，同时上述标记BMSCs构建的TEB均可在裸鼠体内异位成骨。
　　 (3)犬不同个体间基因错配：找到MHCI类基因片段不同的比格犬，MLC显示不同个体间淋巴细胞刺激后增殖水平显著性高于自体淋巴细胞(P＜0.05)。
　　 (4)同种异体比格犬BMSCs体内异位构建TEB：自体、异体BMSCs-支架复合物均能异位成骨，8周前自体BMSCs-支架复合物成骨速率快于异体BMSCs-支架复合物(P＜0.05)，到12周时两组成骨量比较无显著性差异(P＞0.05)，而空白材料不能成骨。异体BMSCs-支架复合物组植入术后7天外周血中IL-2水平较自体BMSCs支架复合物组短暂性升高(P＜0.05)，IL-10水平短暂性降低（P＜0.05），之后两组间IL-2及IL-10水平在各时间点均无显著性差异(P＞0.05)。
　　 (5)同种异体比格犬BMSCs体内原位构建TEB修复骨缺损：术后X线观察发现自体及异体TEB组骨密度随时间延长逐渐增高，空白支架组骨密度逐渐降低。24周CT三维重建和标本大体观察发现自体、异体TEB修复恢复了下颌骨的连续性，骨密度及生物力学检测显示两组间无显著性差异(P＞0.05)。组织学观察，自体、异体TEB组和自体骨移植组示骨基质中骨细胞、骨陷窝及骨断端处骨性连接，空白支架组生物材料降解吸收，缺损区纤维组织连接。术后3天异体TEB组犬外周血TNF-α和INF-γ水平较自体TEB组短暂性升高(P＜0.05)，7天IL-2水平短暂性升高(P＜0.05)，IL-10水平短暂性降低(P＜0.05)，之后两组间TNF-α、INF-γ、IL-2及IL-10水平在各时间点均无显著性差异(P＞0.05)。术后全程淋巴细胞分型两组间无显著性差异(P＞0.05)。
　　 结论：
　　 (1)比格犬BMSCs具备向成骨、成软骨和脂肪方向分化的潜能，与珊瑚支架材料相容性良好。
　　 (2)体外EGFP和CM-Dil标记不影响比格犬BMSCs的增殖能力，裸鼠体内异位构建TEB具备成骨能力。BMSCs复合珊瑚支架植入体内可存活12周以上。
　　 (3)同种异体BMSCs体内异位构建TEB成骨速率慢于自体TEB，两组最终(12周后)成骨能力无差异。异体BMSCs-支架复合物植入早期（7天）受体的免疫反应强于自体BMSCs-支架复合物，最终（12周）两组间无明显差异。
　　 (4)同种异体BMSCs体内原位构建TEB可修复比格犬下颌骨标准缺损。异体TEB修复早期（7天）受体的免疫反应强于自体TEB，最终（12周）两组间无明显差异。

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