• 主题
高级搜索  >
历史搜索 清空历史
首页> 中文学位 >新型汉防己甲素衍生物H1抗耐药作用研究及无毒浓度H1对P-gP表达与功能的影响
【6h】

新型汉防己甲素衍生物H1抗耐药作用研究及无毒浓度H1对P-gP表达与功能的影响

代理获取
页面导航
  • 摘要
  • 著录项
  • 相似文献
  • 相关主题

摘要

目前,肿瘤多药耐药(multi-drug resistance,MDR)已成为肿瘤治疗中面临的一大难题,所谓肿瘤MDR是指肿瘤接触了某些抗癌药物后产生对其他多种未接触过的、结构无关和作用机制完全不同的抗癌药物也具有交叉耐药性。肿瘤MDR产生的机制十分复杂,主要包括:细胞凋亡敏感性降低、细胞存活信号通路的异常活化、药物外排泵ABC转运蛋白(P-glycoprotein,P-gp等)过表达、药物作用靶点的改变、DNA损伤修复活性增强、药物解毒与消除酶活性增强或过表达等。
　　 肿瘤MDR逆转剂是通过抑制转运蛋白的功能或表达,恢复耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。与此不同,抗耐药药物则是通过直接杀伤或抑制耐药肿瘤克服肿瘤MDR。近年来,抗耐药研究越来越受到人们的重视。我国天然产物资源丰富,从天然产物及其衍生物中寻找新型抗耐药化合物或肿瘤MDR逆转剂具有广阔的前景。在此,我们发现汉防己甲素新型衍生物H1在体内、外均显示出良好的抗耐药作用,而且在无毒浓度时能显著逆转P-gp所介导的肿瘤MDR,并对其分子机制进行了初步探讨。
　　 本论文主要分为两部分:第一部分,H1抗耐药药效学评价及其分子机制研究；第二部分,无毒浓度H1逆转P-gp介导的肿瘤MDR作用及对P-gp表达与功能的影响。
　　 第一部分H1抗耐药药效学评价及其分子机制研究
　　 本部分实验主要研究了汉防己甲素新型衍生物H1体内、外抗耐药作用及其对敏感株、耐药株细胞凋亡通路与存活信号通路的影响。采用MTT比色法测定H1对8株不同组织来源肿瘤细胞的细胞毒活性,再以KB、KBv200；MCF-7、MCF-7/adr；A549、A549/tax亲本与其相应的耐药细胞为研究对象,以三种常用的抗肿瘤药物阿霉素(ADR)、紫杉醇(TAX)、长春新碱(VCR)为对照,系统评价了H1体外抗耐药作用。建立敏感性KB、耐药性KBv200裸鼠移植瘤模型,以VCR为阳性对照药,结合KB裸鼠移植瘤模型考察KBv200裸鼠移植瘤模型的体内耐药性,进而采用KB、KBv200裸鼠移植瘤模型评价H1低、中、高(10、15、20mg/kg)三个剂量的抗肿瘤效果,评价H1体内抗耐药作用。PI单染法流式细胞仪检测H1对敏感株细胞KB、耐药株细胞KBv200细胞周期的影响。采用DAPI染色法观察细胞形态学变化；琼脂糖凝胶电泳分析细胞DNA片段化状态；PI-AnnexinV双染法定量检测H1诱导KB、KBv200细胞凋亡作用。JC-1染色法检测H1对KB、KBv200细胞线粒体膜电位的影响。H1处理KB、KBv200细胞24h后,Western blot方法检测内源性凋亡通路相关蛋白:Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3的表达及线粒体膜间隙蛋白细胞色素-C、AIF的释放；外源性凋亡通路相关蛋白:Fas、FasL、Caspase-8的表达；以及细胞存活性信号通路P13K-AKT、MEK-ERK中关键分子p-ERK、ERK、p-AKT、AKT的表达。与此同时,以Bel7042/5-Fu细胞为研究对象,以5-Fu为对照,评价了:Bel7042/5-Fu细胞的耐药特性及H1对Bel7402/5-Fu与Bel7402细胞的生长抑制作用。采用Trizol法提取了Bel7402、Bel7402/5-Fu细胞及H1(4μM)处理细胞24h后的mRNA,以琼脂糖凝胶电泳进行RNA质量检测。采用Affimatrix基因表达芯片平台分析敏感株细胞Bel7402,耐药株细胞Bel7402/5-Fu,以及H1处理后Bel7402、Bel7402/5-Fu细胞全基因组表达水平变化。
　　 研究结果显示:H1对8株不同组织来源的肿瘤细胞都具有不同程度的生长抑制作用,IC50在1-4μM之间,对KB、Bel7402的生长抑制作用较为显著,IC50分别为1.068±0.017、0.671±0.026(μM)。体外抗耐药作用研究显示H1不仅对敏感株细胞具有较好的杀伤作用,而且对耐药株细胞也同样具有显著的抑制作用,平均耐药因子(resistant factor,RF)仅为1.6,而三种抗肿瘤药物TAX、ADR、VCR的平均耐药因子分别为:22.6、71.7、52.3。可见,在体外H1具有良好的抗耐药作用。KB、KBv200裸鼠移植瘤实验表明:在敏感性KB裸鼠模型,VCR给药组的相对肿瘤体积抑制百分率、瘤重抑制百分率分别为:84.4％、82.1％,显示出良好的抗肿瘤效果。但在耐药肿瘤模型(KBv200裸鼠移植瘤模型)VCR给药组的相对肿瘤体积抑制百分率、瘤重抑制百分率则分别为:12.6、27.7％,KBv200细胞在体内仍然对VCR展现良好的耐药作用,证明建立的体内耐药移植瘤模型是成功的。H1无论在敏感性KB裸鼠移植瘤还是在耐药性KBv200裸鼠移植瘤模型都具有显著的抗肿瘤效果,并且显示良好的剂量依赖关系。尤其是H1高剂量组(即20mg/kg)对敏感株KB裸鼠移植瘤的相对肿瘤体积与重量抑制百分率分别为79.7％、79.0％:对耐药株KBv200裸鼠移植瘤的相对肿瘤体积与重量抑制百分率分别为61.5％、74.9％。可见,H1在我们建立的体内移植瘤耐药模型中仍具有良好的抗耐药作用。作用机制显示:H1对KB、KBv200细胞周期分布无显著影响,但我们观察到随着H1浓度的增加出现凋亡峰(Sub-G1)。DPAI染色显示细胞核皱缩、碎裂、染色加深,且凋亡细胞的百分率随着H1浓度的升高而增加。琼脂糖凝胶电泳检测到典型的:DNA片段化(DNALadder)现象。PI-AnnexinV染色后发现H1诱导KB细胞的凋亡作用略强于耐药株细胞KBv200,8μMH1处理组诱导KB细胞晚期凋亡百分率为85.4％,而诱导耐药细胞KBv200细胞晚期凋亡的百分率为42.4％,这一结果与细胞增殖抑制活性结果相一致。无论在敏感细胞KB还是在耐药细胞KBv200,H1均能升高Bax/Bcl-2比例、降低线粒体膜电位、使细胞色素-C、AIF从线粒体释放到胞浆,进而活化Caspase-3,启动内源性凋亡通路；但H1对Fas、FasL、Caspase-8的表达无影响,提示H1诱导KB、KBv200细胞凋亡不依赖于外源性凋亡通路。KB细胞对H1的凋亡敏感性略强于耐药细胞KBv200。同时,H1能显著抑制ERK、AKT的磷酸化水平,下调P13K-AKT、MEK-ERK信号通路,这可能与H1的抗耐药作用相关。
　　 另一方面,Bel7402/5-Fu细胞对5-Fu具有明显的耐药性,耐药因子为161.1,而H1的耐药因子仅为6.0,H1在Bel7402/5-Fu细胞显示出一定的抗耐药作用。基因表达芯片结果显示Bel7402/5-Fu细胞与亲本细胞Bel7402相比,发生主要变化的基因为有非受体酪氨酸激酶FYN(上调),p38MAPK(上调),凋亡效应激酶Caspase-3基因(下调)。JAK-STAT通路相关基因表达上调,AKT基因上调,抗凋亡作用增强。H1处理后Bel7402/5-Fu细胞与亲本细胞Bel7402相比,发生主要变化的有Fas/FasL介导的外源性凋亡相关基因(下调)。非受体酪氨酸激酶FYN(上调),P13K-AKT通路相关基因(上调)。
　　 上述结果表明:无论在体外还是体内,H1均显示出良好的抗耐药作用。其分子机制可能与启动内源性凋亡通路、下调细胞存活通路P13k-AKT、MEK-ERK等有关。
　　 第二部分无毒浓度H1逆转P-gp介导的肿瘤MDR作用及对P-gp表达与功能的影响
　　 本部分实验主要研究了无毒浓度H1对P-gp介导肿瘤MDR的逆转作用并检测其对P-gp表达与功能的影响。采用MTT比色法测定H1对KB、MCF-7与其相应的P-gp过表达耐药株KBv200、MCF-7/adr细胞的生长曲线,以维拉帕米(VRP)为阳性对照药,选择无毒浓度H1(0.125、0.25、0.5μM)与3种抗肿瘤药物VCR、ADR、TAX合用评价其逆转肿瘤MDR作用,并计算逆转倍数(reversal fold,RF)。流式细胞仪测定H1处理后KBv200细胞P-gp对其底物阿霉素、罗丹明123的蓄积与外排功能的影响。Pgp-GloTM试剂盒检测H1对VRP刺激的重组P-gpATPase活性的影响。计算机辅助设计Discovery.Studio分子模拟软件对H1的空间结构与P-gp三维构象进行了分子对接模拟,考察H1分子与P-gp结合能力。Western blot方法检测无毒浓度H1处理KBv200细胞48h后P-gp表达水平,RT-PCR检测MDRI转录水平的变化。引入放线菌酮(CHX)考察0.5μM H1处理后对P-gp半衰期的影响。免疫沉淀法(Immunoprecipitation,IP)检测H1对P-gp泛素化水平的影响。同时考察H1对KBv200细胞MAPK信号通路的影响以及RNAi沉默ERK1与ERK2基因或ERK特异性抑制剂U0126、PD98059对P-gp表达水平的影响。
　　 综上所述,新型汉防己甲素衍生物H1在体内、外均具有良好的抗耐药作用,其分子机制可能与启动内源性凋亡通路、抑制细胞存活通路P13K-AKT、MEK-ERK有关。此外,无毒浓度H1能逆转P-gp介导的肿瘤MDR,不仅能干扰P-gp的转运功能,而且影响P-gp的稳定性,下调P-gp蛋白表达。提示H1对临床MDR肿瘤的治疗可能有一定潜能。

著录项

  • 作者

    魏宁;

  • 作者单位

    北京协和医学院;

    中国医学科学院;

    清华大学医学部;

    北京协和医学院(中国医学科学院);

  • 授予单位 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院(中国医学科学院);
  • 学科 药理学
  • 授予学位 博士
  • 导师姓名 刘耕陶,陈晓光,朱海波,张建军;
  • 年度 2011
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 抗肿瘤、抗癌药物;
  • 关键词

    肿瘤; 抗耐药; 多药耐药; P-糖蛋白; 汉防己甲素; 存活通路;

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱：kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备：11010802029741号 ICP备案号：京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有

  • 客服微信

  • 服务号