iASPP单克隆抗体的制备与应用及iASPP新的剪接体（iASPP-SV）抑制p21转录机制研究

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目的：应用脾脏内注射真核iASPP-SV表达质粒免疫的方法制备抗人iASPP单克隆抗体(McAb)，并对其生物学特性进行初步研究。方法：RT-PCR方法克隆iASPP-SV编码区cDNA。将扩增所得到的全长基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，并将iASPP-SV基因全长和基因片段克隆到原核表达载体pET28a中。诱导PIAF和PIAS载体在大肠杆菌Rosseta(DE3)中表达PIAF和PIAS蛋白。通过盐酸胍变性溶解包涵体，并经镍柱纯化得到重组PIAF和PIAS蛋白。采用脾脏内注射真核pcDNA3.1-iASPP-SV(CIAF)免疫Balb/c小鼠3天后，取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞(NS1)用传统的淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人iASPP单克隆抗体。应用原核表达的iASPP-SV全长及iASPP-SV片段His-tag融合蛋白进行间接ELISA法筛选阳性克隆。并对亚克隆后的阳性杂交瘤细胞株所制备的抗体的生物学功能进行了初步鉴定。结果：我们利用RT-PCR方法从人白血病细胞系U-937中克隆出癌基因iASPP-SV编码cDNA，成功构建iASPP-SV表达载体PIAF、PIAS和CIAF，重组质粒读码框和序列与预期一致。在IPTG诱导下，重组载体大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，表达产物经SDS-PAGE和western blot方法分析证实系PIAS和PIAF融合蛋白。利用Ni2+鳌合层析的方法纯化PIAS和PIAF融合蛋白，经SDS-PAGE鉴定其纯度超过80％。用CIAF质粒通过脾脏内注射免疫所获得的小鼠脾脏细胞通过细胞融合、筛选和克隆化培养最后得到10株单克隆抗体细胞株。我们所获得的抗体能与天然iASPP-SV和iASPP蛋白及重组iASPP-SV蛋白特异性结合，而且实验表明所获得的抗体可以应用于western blot、免疫组织化学等实验。结论：本研究成功地应用脾脏内注射真核iASPP-SV表达质粒免疫制备了针对人iASPP蛋白的抗体，该抗体能够特异识别iASPP-SV和iASPP两个异构体。为进一步对iASPP蛋白水平检测以及其功能、作用机制等实验研究奠定了良好的工作基础。

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作者
刁世勇;
展开▼
作者单位

北京协和医学院;

中国医学科学院;

清华大学医学部;

中国协和医科大学(北京协和医学院);

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授予单位北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;中国协和医科大学(北京协和医学院);
学科内科学(临床基础型)
授予学位博士
导师姓名王建祥,王敏;
年度 2008
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类免疫分子生物学（免疫化学）;转化及克隆;
关键词
免疫生物学; 基因克隆; 真核表达; 质粒免疫;

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