高致病性禽流感病毒H5N1血凝素蛋白H5的融合蛋白在哺乳动物细胞中的高量表达纯化及活性检测

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图表目录

英文略语表

前言

第一部分 H5N1血凝素蛋白H5基因的质粒构建

1 实验材料

1.1 质粒

1.2 菌株

1.3 工具酶、酶切缓冲液及DNA Marker

1.4 主要化学试剂

1.5 试剂盒

1.6 主要仪器及设备

1.7 主要溶液配方

1.8 PCR引物

2 实验方法

2.1 单链复性

2.2 PCR扩增

2.3 酶切消化

2.4 连接

2.5 转化

2.6 鉴定

2.7 感受态细胞的制备

2.8 质粒DNA的小提

2.9 Western blotting的检测方法

2.10 质粒DNA的大量提取

2.11 重组质粒DNA浓度的测定

3 实验结果

3.1 优化H5蛋白，并合成H5蛋白基因

3.2 构建克隆，并检测

3.3 瞬时转染质粒Peak13 CD5L H5 TEV hFc，检测表达量

3.4 扩增去跨膜端△TM：H5蛋白基因

3.5 瞬时转染细胞，检测蛋白的表达

3.6 质粒大提

第二部分 构建稳定表达H5融合蛋白的细胞株

1 实验材料

1.1 细胞培养基及血清

1.2 试剂

1.3 细胞培养耗材

1.4 仪器及设备

1.5 细胞冻存液的配制

1.6 细胞裂解液的配制

1.7 蛋白质电泳及检测缓冲液

1.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制

2 实验方法

2.1 DNA的纯化回收

2.2 贴壁细胞培养

2.3 稳定表达细胞株的构建

2.4 细胞冻存

2.5 细胞复苏

2.6 细胞裂解

2.7 Western blotting的检测方法

2.8 ELISA检测方法

3 实验结果

3.1 质粒线性化并回收线性化的DNA

3.2 将线性化的质粒转染细胞，构建稳定表达细胞株

3.3 检测融合蛋白的正确表达，并测定表达量

第三部分 H5融合蛋白的纯化和生物活性检测

1 实验材料

1.1 试剂与耗材

1.2 主要仪器与设备

2 实验方法

2.1 蛋白纯化

2.2 用流式细胞技术检测表达蛋白的活性

3 实验结果

3.1 蛋白提纯

3.2 融合蛋白的活性检测

讨论

小结

参考文献

综述

参考文献

简历

致谢