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脱色希瓦氏菌S12非特异性偶氮还原酶基因表达及特性

         
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【目的】对脱色希瓦氏菌S12(Shewanella decolorationisS12)的acpD基因(登录号EF198254)及其表达活性进行研究。【方法】采用DNAMAN软件对该基因进行序列分析。利用PCR技术克隆含原有启动子的目的基因,与pGM-T载体连接后转化仅有微弱偶氮还原活性的大肠杆菌TOP10(Escherichia coliTOP10)中进行表达。通过分光光度法测定偶氮染料的还原活性。【结果】序列分析表明,该基因编码198个氨基酸残基组成的多肽,与希瓦氏菌ANA-3(Shewanellasp.ANA-3)的NAD(P)H-醌氧化还原酶基因(登录号CP000469)、奥柰达希瓦氏菌MR-1(Shewanella oneidensisMR-1)的acpD基因(登录号AE014299)编码多肽的氨基酸序列同源性分别高达97%和96%,与E.coliJM109中FMN依赖的NADH-偶氮还原酶(登录号NP-415930)氨基酸序列同源性为61%。它们在蛋白质二级结构排列上非常相似,尤其在活性中心FMN的结合位点(L7、L11环和L3环)上十分保守。同时,acpD基因在E.coli TOP10中的表达赋予了重组菌高效的偶氮还原活性。重组菌完整细胞能快速还原低极性无磺酸基团的甲基红,却不能对强极性多磺酸基团的苋菜红脱色;而当使用细胞粗酶液排除细胞膜屏障以后,强极性多磺酸基团的苋菜红亦能被高效还原。实验中还发现,该酶需要以NADH为电子供体,FMN的添加可显著提高其偶氮还原活性,而氧气的存在则明显抑制其活性。【结论】在E.coliTOP10中表达的偶氮还原酶定位在重组菌胞内,在体内或体外条件下都具有很强的还原不同极性偶氮染料的活性。脱色希瓦氏菌S12的acpD基因表达产物是一种非特异性的FMN依赖型的NADH-偶氮还原酶。该酶以NADH为电子供体,通过FMN结合位点的活性中心把电子传递给偶氮染料,最终实现染料的还原脱色。

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