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基于FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法

         
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目的 利用FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法.方法 构建针对破伤风毒素和B型肉毒毒素的双荧光标记底物的重组表达质粒,表达并纯化荧光标记底物重组蛋白;利用A型肉毒毒素轻链(ALc),B型肉毒毒素轻链(BLc)和破伤风毒素轻链(TIc)分别对目的蛋白进行酶切反应.对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件进行优化.酶动力学参数分别测定TLc和BLc切割底物荧光标记底物的Km和Kcat值.结果 设计并成功构建荧光标记底物的重组表达质粒.表达并纯化后获得纯度为90％左右的重组蛋白,命名为CY-VAMP.利用ALc、BLc和TLc分别对CYVAMP进行酶切,CYVAMP能被BLc和TLc识别切割而不能被ALc切割.对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件优化得到:CYVAMP较适宜的范围为0.2～32 μ.mol/L,酶标仪滤光片灵敏度设定的较合适的设置范围在65～110;(对于96孔板)动态实时检测间隔时间2 min较为合适,检测持续时间从30 min到120 min较合适.CYVAMP在内肽酶BLc作用下随反应时间变化与荧光值528与485比值作图最大时在1.5左右,最小在0.5左右.酶动力学参数测定得到BLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(17.6±2.6)μmol/L和(4.16+0.28) s-1.TLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(40.8±3.5)μmol/L和(2.65±0.32)s-1.结论 成功构建基于FRET技术的分析法能满足对破伤风毒素和B型肉毒毒素的检测及抑制剂的高通量体外筛选所需.

著录项

  • 来源
    《安徽医科大学学报》 |2018年第5期|739-745|共7页
  • 作者

    罗森; 丁朋晓; 李涛; 王琴; 王慧;

  • 作者单位

    遵义医药高等专科学校病原生物与免疫教研室;

    遵义563006;

    遵义医药高等专科学校病原生物与免疫教研室;

    遵义563006;

    军事医学科学院微生物流行病研究所、病原微生物生物安全国家重点实验室;

    北京100071;

    军事医学科学院微生物流行病研究所、病原微生物生物安全国家重点实验室;

    北京100071;

    军事医学科学院微生物流行病研究所、病原微生物生物安全国家重点实验室;

    北京100071;

  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 chi
  • 中图分类 梭状芽胞杆菌属（厌氧杆菌）;
  • 关键词

    FRET; 肉毒毒素; 破伤风毒素; 高通量筛选;

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