长效稳定表达杆状病毒基因传递载体的构建及表达效率研究

王志昇; 李梦婷; 姬勇敢; 杨文; 杨丽; 杨萌萌

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长效稳定表达杆状病毒基因传递载体的构建及表达效率研究

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目的为解决杆状病毒作为基因传递载体瞬时表达缺陷,拟构建睡美人(SB)转座子介导的杆状病毒表达载体,通过检测绿色荧光蛋白EGFP的表达变化来评价该系统在哺乳动物体内外的表达效率.方法以pFastBac DUAL质粒为骨架,将pPh启动子替换为CMV-SB100X-SV40 PA表达元件,然后在其下游插入IR/DR-CMV-EGFP-SV40 PA-IR/DR表达元件,获得的质粒命名为pBacSB-CE;同时作为对照构建pBac-CE,在pPh启动子下游插入CMV-EGFP表达元件.将构建好的重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac,经蓝白斑筛选后转染Sf-9细胞,获得重组杆状病毒BacSB-CE和Bac-CE.将重组病毒转导人胶质瘤U87细胞,通过MTT、倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞的增殖以及EGFP的表达效率;建立裸鼠皮下胶质瘤肿瘤模型,通过组织免疫荧光进一步观察重组病毒在体内的转导效率.结果经PCR鉴定成功获得了重组病毒BacSB-CE和Bac-CE;MTT结果证实重组病毒对U87细胞的增殖无副作用;倒置荧光显微镜和流式结果显示,EGFP在BacSB-CE转导的U87细胞中至少能表达60 d,在转导15 d后仍能检测到约109 a.u.总荧光强度,而在Bac-CE转导的细胞中,15d后已检测不到荧光细胞和荧光信号;体内组织免疫荧光检测进一步显示BacSB-CE组在第10天时仍能检测到绿色荧光细胞,而Bac-CE组在第5天时基本看不到荧光细胞.结论该研究成功构建了SB转座子介导的杆状病毒基因传递系统,获得的重组病毒对哺乳动物细胞具有良好的安全性,并能介导EGFP在哺乳动物体内外持续稳定表达.

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来源
《安徽医科大学学报》 |2021年第3期|386-391|共6页
作者
王志昇; 李梦婷; 姬勇敢; 杨文; 杨丽; 杨萌萌;
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作者单位

宁夏医科大学药学院银川710004;

宁夏医科大学实验动物中心银川710004;

宁夏医科大学药学院银川710004;

宁夏医科大学药学院银川710004;

宁夏医科大学实验动物中心银川710004;

宁夏医科大学实验动物中心银川710004;

宁夏医科大学实验动物中心银川710004;

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原文格式 PDF
正文语种 chi
中图分类血液与循环生理;
关键词
睡美人转座子; 杆状病毒; U87细胞; 持续表达;

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