重组氨基脲敏感型胺氧化酶在293T细胞中的定位及酶活性测定

钱九战; 李蕊; 罗红军; 林哲绚; 施金婉; 罗文鸿

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目的:构建氨基脲敏感型胺氧化酶(SSAO)基因真核表达载体,并在293T细胞中进行瞬时表达,确定SSAO体外表达效率、亚细胞定位及酶活性。方法:以pcDNA3-SSAO质粒为模板,PCR扩增获取SSAO编码区全序列,分别构建SSAO与绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达质粒pEGFP-N3-SSAO和共表达质粒pIRES2-EGFP-SSAO,并通过酶切和测序验证。再分别将pcDNA3-SSAO、pEGFP-N3-SSAO、pIRES2-EGFP-SSAO和pcFLAG-SSAO重组质粒瞬时转染293T细胞,在荧光显微镜下观察目的蛋白的分布及表达情况。采用高效液相色谱法(HPLC)测定转染上述4种重组质粒及相应空质粒细胞的SSAO活性。结果:测序结果表明重组真核表达质粒构建正确。在瞬时转染pEGFP-N3-SSAO和pIRES2-EGFP-SSAO重组质粒的293T细胞中,转染后3~36 h各组均可观察到绿色荧光,且转染36 h为最佳观察时间点。转染pIRES2-EGFP-SSAO质粒的绿色荧光分布于细胞质中;转染pEGFP-N3-SSAO和pcFLAG-SSAO质粒的绿色荧光及红色荧光均分布于细胞膜上。酶活性检测结果显示转染pcFLAG-SSAO、pIRES2-EGFP-SSAO和pcDNA3-SSAO载体质粒的293T细胞中的SSAO活性分别为111.50±7.07、117.22±9.54、215.74±21.44 nmoL/(mg·h),较各自的空白质粒对照组均显著升高(P均<0.01),但转染pEGFP-N3-SSAO质粒的细胞SSAO活性极低,仅为2.09±0.29 nmoL/(mg·h)。结论:293T细胞中,体外重组表达的SSAO蛋白主要分布于细胞膜上,以pcDNA3为载体外源表达的天然状态SSAO活性最高。

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来源
《癌变．畸变．突变》 |2017年第4期|277-283|共7页
作者
钱九战; 李蕊; 罗红军; 林哲绚; 施金婉; 罗文鸿;
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作者单位

汕头大学医学院生物分析实验室;

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原文格式 PDF
正文语种 chi
中图分类基因载体;
关键词
氨基脲敏感型胺氧化酶; 重组表达; 亚细胞定位; 酶活性测定;

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