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耐砷A216T错义突变型PML-RARα质粒的构建及雄黄对其蛋白产物影响及机制

         
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目的 构建PMLA216T-RARα过表达质粒,并研究雄黄对其蛋白产物的影响及机制.方法 通过资料库及文献获得PML、RARα的mRNA序列,以及PML-RARα[的融合位点.设计引物后,通过聚合酶链反应获得目的 片段,通过无缝克隆技术连接两个片段,插入突变,并与载体质粒相连接,测序验证.转染质粒至HL-60细胞,血清饥饿法处理24 h后用Western blot观察PML-RARα、p-mTOR、p62、LC3B水平变化;不同浓度的雄黄处理24 h后,用Western blot观察PML-RARα、p-mTOR、p62、LC3B水平变化.结果 测序结果显示质粒构建成功,序列符合预期设计.1、2、4、8μmol/L雄黄处理后PMLWT-RARα和PMLA216T-RARα水平低于未经雄黄处理(0μmol/L)的PMLWT-RARα和PMLA216T-RARα水平,差异有统计学意义(P＜0.05);0.5 μmol/L雄黄处理后PMLWT-RARα水平低于未经雄黄处理的PMLWT-RARα水平,差异有统计学意义(P＜0.05).相同浓度雄黄处理后PMLA216T-RARα水平高于PMLWT-RARα水平,差异有统计学意义(P＜0.05).5％ FBS和未经FBS处理的PMLA216T-RARα、p-mTOR水平低于10％ FBS处理的PMLA216T-RARα、p-mTOR水平,p62、LC3B水平高于10％ FBS处理的PMLA216T-RARα水平,差异有统计学意义(P＜0.05).4、8、16、32、64 μmol/L雄黄处理后PMLA216T-RARα水平低于未经雄黄处理的PMLA216T-RARα水平,差异有统计学意义(P＜ 0.05);8、16、32、64μmol/L雄黄处理后p-mTOR、p62水平低于未经雄黄处理的p-mTOR、p62水平,LC3B水平高于未经雄黄处理的LC3B水平,差异有统计学意义(P＜0.05);16 μmol/L雄黄处理后p-mTOR、p62水平低于8μmol/L雄黄处理后的p-mTOR、p62水平,LC3B水平高于8 μmol/L雄黄处理后的LC3B水平,差异有统计学意义(p＜0.05).结论 错义突变型PMLA216T-RARα过表达质粒构建成功,高浓度雄黄可能通过选择性自噬下调PMLA216T-RARα.

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