人心肌C蛋白诱导建立实验性自身免疫性心肌炎模型

韩丽娜; 李铁岭; 丁国雷; 刘健伟; 丁宇; 张亚晶

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人心肌C蛋白诱导建立实验性自身免疫性心肌炎模型

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目的构建人心肌C蛋白（cardiac C protein,CCP）具有免疫原性肽段的重组质粒,并在大肠杆菌中表达,纯化和复性重组蛋白,并利用重组蛋白免疫建立实验性自身免疫性心肌炎（EAM）大鼠模型。方法提取人心肌总RNA,反转录生成cDNA,PCR扩增从人CCP基因组中获得具有免疫原性肽段基因片段。通过克隆载体pEASY-T1进行CCP基因克隆,用插入失活筛选法筛选阳性重组体,菌检PCR和核酸序列测定。将阳性克隆与原核表达载体pQE30双酶切,将CCP具有免疫原性肽段和表达载体连接,转化到大肠杆菌感受态细胞M15中表达,菌检PCR筛选阳性克隆大量合成蛋白。六组氨酸标签蛋白（His-tag）蛋白质纯化方法提纯重组蛋白,在pH值3.0、0.1 mol/L甘氨酸和盐酸缓冲液中通过半透膜恢复重组蛋白的天然结构。100μg CCP和2.5 g/L完全氟氏佐剂充分混合,Lewis大鼠双足垫等量注射,0.5μg百日咳毒素腹腔注射建立EAM模型。在免疫注射后第2、4、6和8周,行心脏血液动力学检测后处死实验动物行心肌组织病理学检测。结果琼脂糖凝胶电泳扩增所得人CCP片段为1000 bp左右,与预期大小一致。构建重组克隆载体后,提质粒经过核酸序列分析后,得出克隆片段与CCP基因序列一致。构建重组表达载体后,菌检PCR得到的目的片段为1000 bp左右,与预期大小一致。包涵体形式表达重组蛋白占细胞总蛋白的80%～90%。纯化CCP垂直凝胶电泳相对分子质量在35 000左右,与预期大小一致,纯度达90%以上。用抗6×His-Tag抗体做Western blot检测,诱导后高表达的蛋白质条带和纯化后的蛋白质在相同的电泳位置上出现染色条带。EAM大鼠,2周是急性、炎症性心肌炎病程阶段,4周是炎症性心肌炎和纤维化心肌炎并存的亚急性阶段,6周是慢性扩张型心肌病阶段。结论结合使用基因克隆技术和六组氨酸标签蛋白纯化技术可成功构建人CCP,并可免疫注射用于建立EAM模型。

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来源
《中华心血管病杂志》 |2012年第8期||共页
作者
韩丽娜; 李铁岭; 丁国雷; 刘健伟; 丁宇; 张亚晶;
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作者单位

1. 解放军总医院南楼心血管一科 2. 解放军总医院南楼干部理疗科 3. 解放军总医院南楼;

老年医学研究所;

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正文语种 chi
中图分类 R542.21;
关键词
心肌炎; 模型; 动物; 心肌C蛋白;

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