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高效液相色谱-串联质谱法结合稳定同位素标记肽段同时测定稻米及其制品中3种过敏蛋白质

         
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基于稳定同位素标记特征肽段和液相色谱-质谱联用仪建立稻米及制品中3种过敏蛋白质的同时定量方法.稻米及制品样品经盐溶液提取,赖氨酰基内切酶(Lys-C)和胰蛋白酶依次水解,C18-SD柱净化后,采用纳升高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱(NanoLC-LTQ-Orbitrap)采集和Protein Discovery软件鉴定,NCBI和Uniprot数据库的基本局部搜索比对工具(BLAST)筛选验证,最终获得表征稻米及制品中 α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂类蛋白质(seed allergenic protein RAG2,RAG2)、乙二醛酶Ⅰ活性蛋白(glyoxalaseⅠ)和α-球蛋白(19 kDa globulin)3种过敏蛋白质的特异性肽段.3个特异性肽段经液相色谱梯度洗脱,在Poroshell色谱柱上实现完全分离,由三重四极杆质谱仪分析.实验通过优化多反应监测(MRM)质谱参数,比较不同溶剂体系、水解酶种类和酶量等酶解条件,结合内标法定量,实现对稻米及制品中3种蛋白质的绝对定量.实验结果表明,当酶解溶剂中含1g/L十二烷基硫酸钠,采用Lys-C和胰蛋白酶组合消化策略,可有效提高3种蛋白质的酶切效率至65.7％～97.3％.该方法在1～200 nmol/L范围内线性关系良好,相关系数均大于0.9972,3种蛋白质的检出限和定量限分别为3 mg/kg和10 mg/kg.3种蛋白质在空白稻米制品基质中3个水平下的加标回收率为80.6％～103.7％,日间和日内精密度均小于11.5％.该方法稳定性好,检测灵敏度高,操作简便,在分析各类稻米及制品中3种过敏蛋白质含量具有广泛的应用前景.

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