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CCCTC结合因子对翼状胬肉中B淋巴细胞瘤-2基因表达的调控及其机制

         
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目的探讨转录因子CCCTC结合因子(CTCF)对翼状胬肉中B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)表达的调控及其分子机制。方法纳入2017年6月至2019年2月在长沙市第一医院眼科行翼状胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植术治疗的原发性翼状胬肉患者22例,术中收集翼状胬肉组织作为翼状胬肉组;同期纳入因结膜裂伤、眼球破裂伤或眼球穿通伤就诊的眼外伤患者20例,取眼外伤修复手术过程中切取的少量正常结膜组织作为正常结膜组。分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测各组样本中CTCF及Bcl-2的表达水平;采用亚硫酸氢盐处理后测序法(BSP)检测各组样本中Bcl-2启动子DNA甲基化水平。分离并培养翼状胬肉成纤维细胞,使用波形蛋白抗体进行免疫组织化学鉴定成纤维细胞。将分离培养的细胞分成2个组,CTCF干扰组转染CTCF干扰质粒,对照组转染对照质粒。采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测CTCF、Bcl-2表达水平;采用细胞计数试剂盒8检测各组培养12、24和48 h细胞增生活性;采用BSP检测各组样本中Bcl-2启动子DNA甲基化水平。比较各组各指标差异,采用Pearson线性相关分析探讨翼状胬肉组织中Bcl-2 mRNA与CTCF蛋白及Bcl-2基因启动子甲基化水平的相关性。结果翼状胬肉组CTCF mRNA及蛋白相对表达水平分别为7.23±3.34和0.92±0.21,明显高于正常结膜组的1.10±0.44和0.28±0.07,差异均有统计学意义(t=-8.136、-13.025,均P<0.01)。翼状胬肉组Bcl-2 mRNA及蛋白相对表达水平分别为10.27±4.64和0.95±0.27,高于正常结膜组的1.10±0.41和0.32±0.14,差异均有统计学意义(t=-8.789、-10.782,均P<0.01)。翼状胬肉组CTCF蛋白相对表达量与Bcl-2 mRNA相对表达量呈显著正相关(r=0.746,P<0.01)。翼状胬肉组Bcl-2启动子区DNA甲基化水平为0.65±0.09,低于正常结膜组的0.83±0.06,差异有统计学意义(t=7.408,P<0.01)。翼状胬肉组Bcl-2启动子DNA甲基化水平与Bcl-2 mRNA相对表达量呈显著负相关(r=-0.635,P<0.01)。CTCF干扰组CTCF及Bcl-2 mRNA相对表达水平为0.37±0.03和0.53±0.06,明显低于对照组的1.02±0.06和0.99±0.07,差异均有统计学意义(t=20.035、9.029,均P<0.01);CTCF干扰组CTCF及Bcl-2蛋白相对表达水平为0.23±0.06和0.56±0.07,低于对照组的0.52±0.05和0.92±0.12,差异均有统计学意义(t=6.914、4.719,均P<0.01)。CTCF干扰组转染后12、24和48 h细胞活力分别为0.10±0.01、0.17±0.01和0.38±0.04,低于对应时间点对照组的0.12±0.01、0.29±0.01和0.85±0.06,差异均有统计学意义(t=3.718、18.350、15.621,均P<0.01)。CTCF干扰组Bcl-2启动子DNA甲基化水平为0.75±0.04,明显高于对照组的0.61±0.03,差异有统计学意义(t=-4.472,P<0.05)。结论翼状胬肉中CTCF高表达,其可能通过下调启动子DNA甲基化水平介导Bcl-2异常表达。

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