大鼠半胱氨酸蛋白水解酶-3基因真核表达质粒和RNA干扰质粒的构建及鉴定

吴靖平; 朱斌; 丁磊; 李德芳

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目的构建SD大鼠半胱氨酸蛋白水解酶（Caspase）-3的真核表达质粒和干扰质粒,探究干扰质粒对Caspase-3表达的干预效应。方法从SD大鼠软骨终板细胞中获得模板cDNA并扩增,约834 bp。克隆至载体pEGFP-N1,获得重组质粒pEGFP-N1-Caspase-3。针对Caspase-3设计4对RNAi靶点序列,克隆至载体pcDNA6.2。成功构建pcDNA6.2-Caspase--3 1、pcDNA6.2-Caspase-3-2、pcDNA6.2-Caspase-3-3、pcDNA6.2-Caspase-3-4,构建对照质粒pcDNA6.2-miRNA。将5个干扰质粒分别与pEGFP-N1-Caspase-3（用量比为7:1）共转染至293T细胞,qPCR检测转染48 h后对Caspase-3表达的干预效应。结果通过菌落聚合酶链反应（PCR）、酶切及测序表明pEGFP-N1-Caspase-3和干扰质粒构建成功;共转293T细胞后,qPCR示pcDNA6.2-Caspase-3-2、pcDNA6.2-Caspase-3-3干预组的Caspase-3的表达高于对照组,分别为33%和8%,而pcDNA6.2-Caspase-3-1、pcDNA6.2-Caspase-3-4干预组的Caspase-3的表达与对照组比较明显减少,抑制效率分别为24%和67%（P＜0.05）。结论成功构建了Caspase-3的表达质粒和干扰质粒,并证实pcDNA6.2-Caspase-3-4对Caspase-3的表达具有明显的抑制效应。

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来源
《中华实验外科杂志》 |2011年第9期||共页
作者
吴靖平; 朱斌; 丁磊; 李德芳;
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作者单位

复旦大学附属金山医院骨科;

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正文语种 chi
中图分类 R681.53;
关键词
RNA干扰; 半胱氨酸蛋白水解酶-3; 质粒;

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