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微小RNA-433调控组蛋白去乙酰化酶6抑制胶质瘤增殖与侵袭

         
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目的探讨脑胶质瘤组织中微小RNA（miR）-433、组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）的表达水平及miRNA-433对脑胶质瘤细胞增殖、侵袭的影响和作用机制。方法 （1）收集新乡医学院第一附属医院神经外科自2010年1月至2014年12月手术切除并经病理检查证实的脑胶质瘤标本42例（低级别14例,高低级别28例）,另外选取同期因颅脑外伤手术切除的正常脑组织标本13例。采用RT-PCR检测脑胶质瘤组织和正常脑组织miRNA-433、HDA C6 mRNA的表达。（2）体外常规培养脑胶质瘤U251细胞,分为空白对照组、无义序列对照组和miRNA-433模拟物组,后2组分别转染无义序列和miRNA-433模拟物,空白对照组不做处理。RT-PCR检测细胞miRNA-433和HDAC6、P21mRNA的表达。CCK-8法检测培养1～5 d时的细胞存活率。流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率。Transwell实验检测细胞的侵袭能力。Western blotting检测细胞HDAC6蛋白的表达。（3）构建野生型（WT）HDAC6 3’-UTR、突变型（MUT）HDAC6 3’-UTR荧光报告载体。将miR-433模拟物+WTHDAC6 3’-UTR、无义序列+WT HDAC6 3’-UTR分别转染U251细胞,双荧光素酶实验检测2组细胞的荧光强度。将miR-433模拟物+MUT HDAC6 3’-UTR、无义序列+MUT HDAC6 3’-UTR分别转染U251细胞,双荧光素酶实验检测2组细胞的荧光强度。（4）将U251细胞分为无义序列对照组、HDAC6表达质粒组、HDAC6 siRNA组,分别转染无义序列、HDAC6表达质粒和HDAC6siRNA后RT-PCR检测细胞P21、HDA C6mRNA及miRNA-433的表达。将U251细胞分为miR-433模拟物组、miR-433模拟物+HDAC6表达质粒组,分别转染miR-433模拟物、miR-433模拟物+HDAC6表达质粒后1～5d时采用CCK-8法检测细胞存活率。结果 （1）高级别脑胶质瘤、低级别脑胶质瘤、正常脑组织中miRNA-433的表达水平逐渐增高,HDA C6mRNA的表达水平逐渐降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。脑胶质瘤组织中二者的表达呈负相关关系（r=0.829,P=0.000）。（2）与空白对照组和无义序列对照组比较,miRNA-433模拟物组U251细胞miRNA-433、P21 mRNA表达水平升高,HDA C6mRNA表达水平降低,培养2～5 d时细胞存活率降低,G0/G1期细胞所占比例增高,细胞凋亡率升高,穿膜细胞数减少,HDAC6蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。（3）miR-433模拟物+WTHDAC6 3’-UTR组细胞的荧光素酶活性明显低于无义序列+WT HDAC63’-UTR组,差异有统计学意义（P＜0.05）;miR-433模拟物+MUTHDAC63’-UTR组和无义序列+MUTHDAC63’-UTR组细胞的荧光素酶活性比较差异无统计学意义（P＞0.05）。（4）HDAC6siRNA组、无义序列对照组、HDAC6表达质粒组细胞HDA C6mRNA的表达水平逐渐增高,P21mRNA的表达水平逐渐降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。培养2～5 d时,miR-433模拟物+HDAC6表达质粒组细胞存活率高于miR-433模拟物组,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 miRNA-433在脑胶质瘤组织中呈低表达水平,过表达miRNA-433可能通过调控HDAC6抑制脑胶质瘤细胞的侵袭、增殖,并促进细胞凋亡。

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