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限时进食在小鼠和细胞模型中通过溶酶体生物发生缓解非酒精性脂肪性肝炎

         
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目的:探讨AMP活化蛋白激酶(AMPK)/转录因子EB(TFEB)介导的溶酶体生物发生在限时进食(TRF)对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠肝脏及油酸(OA)诱导的人肝母细胞瘤HepG2细胞损伤的缓解作用及其分子机制。方法:(1)用高脂高胆固醇饮食构建小鼠NASH模型,将18只C57BL/6J小鼠分为正常对照(NC)组、模型(model)组和TRF组,每组6只。饲养10周后麻醉小鼠,摘眼球取血,分离血清,检测小鼠血清中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平;收集小鼠肝脏,计算肝脏系数,检测肝脏TC和TG的水平。苏木精-伊红(HE)和Masson马松染色观察肝脏形态学变化;Western blot法检测肝脏溶酶体关联膜蛋白1(LAMP1)、AMPK、p-AMPK和核TFEB、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)蛋白表达水平。(2)用OA干预HepG2细胞建立肝损伤模型,用血清剥夺模拟禁食条件。将HepG2细胞分为对照(control)组、血清剥夺(FBS-)组、OA组和OA+FBS-组;用siRNA敲低TFEB探讨TFEB介导的溶酶体生物发生与肝细胞脂质积累和肝损伤的关系;用AMPK抑制剂化合物C(CC)抑制AMPK活性研究AMPK与TFEB介导的溶酶体生物发生的关系。油红O染色检测肝细胞脂质积累;试剂盒检测肝细胞TG、TC、ALT和AST水平;Western blot法检测肝细胞LAMP1、AMPK、p-AMPK和核TFEB蛋白表达水平。结果:(1)TRF干预显著降低了NASH小鼠的血清TC、TG、ALT和AST水平及肝脏中IL-1β、TNF-α、TG和TC的表达,缓解了肝组织中的脂肪变性和炎症浸润(P<0.05);(2)血清剥夺干预减少了OA诱导的HepG2细胞中的脂滴数量以及TG、ALT和AST水平(P<0.01);(3)Western blot结果显示,TRF干预后NASH小鼠肝脏中TFEB核易位水平、LAMP1蛋白水平和AMPK磷酸化水平显著升高(P<0.01);血清剥夺干预后,OA诱导的HepG2细胞中TFEB核易位水平、LAMP1蛋白水平和AMPK磷酸化水平显著增加(P<0.01);(4)siRNA干预后,TFEB和LAMP1蛋白水平降低,血清剥夺对OA组脂肪积累和肝损伤的改善作用被显著削弱(P<0.05);(5)CC干预后,AMPK磷酸化水平、LAMP1蛋白水平和TFEB核易位水平显著降低(P<0.01)。结论:(1)TRF能够减轻NASH小鼠肝脏的脂质积累和炎症;(2)TRF对NASH小鼠肝脏的有益作用可能与其促进AMPK/TFEB介导的溶酶体生物发生有关。

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