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GPX4 m^(6)A修饰在脓毒症诱导急性肺损伤小鼠肺上皮细胞铁死亡过程中的调控作用

         
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目的:分析在脓毒症诱导的小鼠肺上皮细胞系MLE-12凋亡和小鼠急性肺损伤(ALI)过程中铁死亡的作用,并探讨谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)在这一过程的调节作用。方法:体外实验1将MLE-12细胞分为对照组、铁死亡抑制剂ferrostatin-1(Fer-1)组、脂多糖(LPS)组和LPS+Fer-1组,以考察铁死亡参与LPS诱导的MLE-12细胞凋亡;实验2将细胞分为:载体组和GPX4组,以考察GPX4对LPS刺激诱导的MLE-12细胞损伤的影响;实验3将细胞分为:si-WTAP+si-NC组和si-WTAP+si-GPX4组,以考察Wilms肿瘤1相关蛋白(WTAP)对GPX4驱动的铁死亡影响。LPS刺激MLE-12细胞建立体外模型,然后将细胞用Fer-1和转染GPX4过表达质粒、WTAP特异性siRNA(si-WTAP)、GPX4特异性siRNA(si-GPX4)进行处理。分别通过CCK-8测定细胞活力,流式细胞术分析细胞凋亡,DCFH-DA测定细胞内活性氧(ROS)水平,荧光探针测定细胞内Fe^(2+)水平和Western blot分析GPX4和WTAP表达水平。体内实验将小鼠随机分为4组:对照组、假手术组、盲肠结扎穿刺(CLP)12 h组和CLP 24 h组,每组12只。进行H&E染色以评估小鼠的肺损伤,并采用试剂盒法检测肺匀浆中的铁含量、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平。结果:与对照组相比,随着LPS暴露时间的延长,细胞中ROS水平和Fe^(2+)水平显著增加(P<0.05),铁死亡标志物GPX4的蛋白表达逐渐降低,WTAP蛋白水平以及WTAP/GPX4比例显著增加(P<0.05)。相对于LPS组,在LPS+Fer-1组中细胞活力显著增加(P<0.05),细胞凋亡百分率、ROS水平和Fe^(2+)水平显著降低(P<0.05)。与载体组相比,GPX4组细胞中GPX4表达及细胞活力显著增加(P<0.05),细胞凋亡百分比、ROS水平和Fe^(2+)水平显著降低(P<0.05)。与si-WTAP+si-NC组相比,si-WTAP+si-GPX4组MLE-12细胞中ROS水平和Fe^(2+)水平显著增加(P<0.05)。与假手术组相比,CLP 12 h组和CLP 24 h组小鼠肺组织学评分和肺匀浆中铁含量、MDA水平和WTAP蛋白表达显著升高(P<0.05),肺组织中GPX4蛋白表达和GSH水平显著降低(P<0.05)。结论:WTAP介导的m^(6)A修饰可能是GPX4的上游目标,并通过降低GPX4水平以促进脓毒症诱导的MLE-12细胞凋亡和小鼠ALI过程中的铁死亡。

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