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首页> 中文期刊> 《中国药理学与毒理学杂志》 >基于钙激活氯离子通道的Piezo1通道调节剂高通量筛选模型的构建

基于钙激活氯离子通道的Piezo1通道调节剂高通量筛选模型的构建

         
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目的 构建基于钙激活氯离子通道蛋白1(ANO1)的Piezo1调节剂高通量筛选模型.方法 RT-PCR和Western印迹法分别检测Fischer大鼠甲状腺上皮(FRT)细胞Piezo1 mRNA和蛋白表达.构建共表达增强型绿色荧光蛋白标记的ANO1(ANO1-EGFP)和黄色荧光蛋白双突变体(YFP-H148Q/I152L)的FRT细胞株(简称FRT模型细胞),倒置荧光显微镜检测ANO1-EGFP和YFP-H148Q/I152L在FRT模型细胞中的表达,加入ANO1激活剂离子霉素10μmol·L-1,应用荧光淬灭动力学实验检测并计算FRT模型细胞相对荧光强度变化值.加入Piezo1调节剂Jedi1(200μmol·L-1),Jedi2(150μmol·L-1),Yoda1(20μmol·L-1)和Gd3+(20μmol·L-1),应用荧光淬灭动力学实验检测并计算FRT模型细胞相对荧光强度变化值.加入Piezo1激活剂Jedi1,Jedi2和Yoda1,按0.2,1,5,10,25,50,75,100,200,300,400,500,600,700,800,900和1000μmol·L-1设置浓度梯度,应用荧光淬灭动力学实验检测并计算FRT模型细胞相对荧光强度变化值并绘制浓度依赖曲线.向FRT细胞中加入Yoda1,按同样的方法设置浓度梯度,通过Fura-2/AM荧光探针检测细胞内的钙信号随Yoda1浓度的变化,分析细胞内Ca2+浓度与FRT模型细胞相对荧光强度变化值之间的关系.计算模型Z′因子及信噪比.结果 RT-PCR、DNA测序比对和Western印迹结果表明,FRT细胞内源性表达Piezo1.ANO1-EGFP和YFP-H148Q/I152L表达清晰,位置正确,并且ANO1-EGFP被离子霉素激活后模型荧光淬灭,证实转染基因表达的蛋白具有生物学活性,FRT模型细胞构建成功.FRT模型细胞加入Jedi1,Jedi2和Yoda1荧光均淬灭,加入Gd3+后再加入Yoda1荧光不淬灭,证实模型可以用于筛选Piezo1通道调节剂;在FRT模型细胞中离子霉素的EC50为(7.76±0.53)μmol·L-1,Yoda1的EC50为(17.27±1.21)μmol·L-1,Jedi1的EC50为(200.60±4.46)μmol·L-1,Jedi2的EC50为(158.10±4.65)μmol·L-1.FRT模型细胞相对荧光强度变化值与细胞内Ca2+浓度呈正相关,模型能敏感地反应细胞内钙信号变化.模型Z′因子为0.82,信噪比为13.29:1,可用于Piezo1通道调节剂高通量筛选.结论 成功构建了可快速、准确、便捷筛选Piezo1通道激活剂和抑制剂的高通量筛选模型.

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