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鸡IL-17A真核表达质粒的构建及其对IBD rVP2亚单位疫苗的免疫佐剂效应

         
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为探究鸡白介素-17A(IL-17A)真核表达质粒对鸡传染性法氏囊病(IBD)rVP2亚单位疫苗的免疫佐剂效应,本研究采用RT-PCR方法扩增鸡IL-17A基因,将其克隆于原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-chIL-17A,将其转化BL21(DE3)大肠杆菌,诱导表达重组蛋白rchIL-17A,通过SDS-PAGE检测后,经His色谱层析柱纯化rchIL-17A,纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,并通过ELISA鉴定。同时将鸡IL-17A基因克隆于真核表达载体pVAXI中构建重组质粒pVAX-chIL-17A,将pVAX-chIL-17A肌肉注射鸡7 d后经western blot检测其的表达。将21日龄SPF鸡随机分为4组,分别为对照组、pVAX-chIL-17A组、rVP亚单位疫苗组、pVAX-chIL-17A+rVP亚单位疫苗组,免疫后通过ELISA检测各组鸡血清中IBD病毒(IBDV)特异性抗体水平(0、14 d、28 d、42 d和56 d)和IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A、IFN-γ及TNF-α的分泌水平(28 d),通过流式细胞术检测各组鸡脾细胞中CD4+T和CD8+T细胞亚群的比例(14 d和28 d)。RT-PCR扩增结果显示获得了约为420 bp的目的片段,并构建原核表达质粒后经诱导纯化后得到了rchIL-17A;将其免疫小鼠后经ELISA检测,结果显示获得了其多克隆抗体。将构建的重组质粒pVAX-chIL-17A免疫鸡后,western blot分析结果显示,注射部位肌肉组织中目的蛋白正确表达。将SPF鸡分组免疫后,ELISA检测结果显示,pVAX-chIL-17A+IBD rVP2亚单位疫苗组各时间点的IBDV特异性抗体水平均显著或极显著高于rVP2亚单位疫苗单独免疫组(P<0.05、P<0.01、P<0.001);pVAX-chIL-17A单独及与rVP2亚单位疫苗共同免疫28 d后,鸡血清中IL-2、IL-6、IL-17A及TNF-α的分泌水平相较其它组显著提高(P<0.05、P<0.01),而IFN-γ和IL-4分泌水平无明显变化。流式细胞术检测结果显示,与对照组相比,单独免疫pVAX-chIL-17A 14 d及28 d后鸡脾细胞中CD4+T和CD8+T细胞的占比均极显著增加(P<0.01、P<0.001);与rVP亚单位疫苗单独免疫组相比,pVAX-chIL-17A与rVP2亚单位疫苗共同免疫14 d及28 d后鸡脾细胞中CD4+T和CD8+T细胞的占比均显著增加(P<0.001);pVAX-chIL-17A与rVP2亚单位疫苗共同免疫28 d后鸡脾细胞CD4+T/CD8+T细胞比值极显著高于rVP2亚单位疫苗单独免疫组(P<0.001)。本研究首次证实pVAX-chIL-17A可以显著增强IBD基因工程亚单位疫苗(rVP2)的免疫水平,为新型高效鸡免疫佐剂的研发奠定了基础。

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