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稳定表达T7RNA聚合酶PK-15细胞系的建立

         
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摘要

To establish a PK-15 cell line stably expressing T7 RNA polymerase (T7 RNAP), the T7 RNAP gene was amplified by PCR from E. coli BL21 (DE3) cells and inserted into the retroviral plasmid vector pLXSN to construct the recombinant plasmid pLXSN-T7. The pLXSN-T7 was transfected into PT67 cells to prepare the recombinant retrovirus (rMLV-T7)in the presence of G418. The PK-15 cells stably expressing the T7 RNAP. designated PK/T7, was established by rMLV-T7 infection, G418 selection and immunofluorescence assay. T7 RNAP transcription activity was detected in the PK/T7 cells via transfection with pET-RED for transient expression of red fluorescent protein. These results indicated that the PK/T7 cells could be an useful tool for reverse genetic manipulation of porcine RNA viruses.%为构建稳定表达T7 RNA聚合酶(RNAP)的猪肾细胞系(PK-15),本研究采用PCR方法,以E.coli BL21(DE3)细菌基因组为模板扩增T7 RNAP基因,将其克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒pLXSN-T7.采用脂质体将pLXSN-T7转染至PT67细胞中,经G418筛选培养获得重组逆转录病毒rMLV-T7,将其接种于PK-15细胞进行G418加压筛选和纯化;应用PCR、间接免疫荧光试验及T7启动子控制下的红色荧光蛋白的重组表达质粒(pET-RED)进行瞬时表达,检测T7 RNAP的表达及活性,结果表明筛选所得的细胞系PK/T7的不同代次均具有转录活性.本研究建立稳定表达T7 RNAP的细胞系PK/T7,为实现细胞内T7启动的转录和猪源RNA病毒等的反向遗传操作提供了有效的方法.

著录项

  • 来源
    《中国预防兽医学报》 |2011年第5期|358-361|共4页
  • 作者

    黄俊华; 贺番; 孙元; 张鑫; 常天明; 李宏宇; 仇华吉;

  • 作者单位

    中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江,哈尔滨,150001;

    中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江,哈尔滨,150001;

    中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江,哈尔滨,150001;

    中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江,哈尔滨,150001;

    中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江,哈尔滨,150001;

    中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江,哈尔滨,150001;

    中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江,哈尔滨,150001;

  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 chi
  • 中图分类 家畜病毒学;
  • 关键词

    逆转录病毒载体; T7RNA聚合酶; 稳定细胞系;

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