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单链构象多态性与核酸杂交联合检测耐氧氟沙星的结核分枝杆菌

         

摘要

目的探讨聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)并Southern杂交检测耐氧氟沙星(OFLX)结核分枝杆菌的可行性,并探索结核分枝杆菌对OFLX敏感与耐药的界限。方法(1)体外筛选人工诱变的耐OFLX的耐药突变株,并检测OFLX对这些耐药株的最低抑菌浓度(M IC)和最低杀菌浓度(MBC)。(2)扩增结核分枝杆菌的gyrA基因,包括H37Rv 1株、H37Ra 1株、临床分离的OFLX敏感株10株及人工诱变的耐OFLX H37Rv(17株)、H37Ra(17株)及临床分离菌株(51株)共计85株,并对此扩增产物进行SSCP分析及Southern杂交,对比观察耐OFLX结核分枝杆菌的核酸单链条带位移的变化。为了验证PCR-SSCP并Southern杂交结果的可重复性,对36株临床分离的耐OFLX菌株的耐药界限进行初步检测。结果经PCR-SSCP及Southern杂交,85株人工诱变的耐OFLX菌株,全部检测到gyrA基因突变。在OFLX 10μg/m l这一点上,明显地存在着一个结核分枝杆菌对OFLX敏感与耐药并存的交叉区。对36株临床分离的OFLX耐药菌的PCR-SSCP合并Southern杂交检测结果显示,对比标准株H37Ra,在临床分离的耐OFLX菌株间观察到了类似的因单链构象变化而引起的单链位移的结果。结论PCR-SSCP合并Southern杂交可以清晰地区分对OFLX敏感与耐药的菌株,以10μg/m l为界作为判别结核分枝杆菌对OFLX是否已经产生耐药的标准是适宜的。

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