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bta-miR-302c影响牛病毒性腹泻病毒复制的研究

         
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为了探索bta-miR-302c通过调控天然免疫(JAK/STAT)信号通路影响牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的作用机理,试验应用miRbase、Microcosm Targets、TargetScan等生物信息学平台预测与抗病毒JAK/STAT信号通路相关的bta-miR-302c靶基因及miRNA识别位点;将bta-miR-302c模拟物(Agomir)和阻抑物(Antagomir)以及阴性对照物(Control Agomir)转染至MDBK细胞中,采用Western-blot和实时荧光定量PCR检测SOCS3蛋白及mRNA表达情况;将SOCS3基因3′UTR miRNA识别位点及其突变体克隆至双荧光素酶报告载体pmiRGLO中,构建pmiRGLO-SOCS3-MRS和pmiRGLO-SOCS3-MRS-M质粒,再分别与bta-miR-302c Agomir共转染至HEK-293T细胞中,48 h后测定相对荧光素酶反应强度;分别将bta-miR-302c Agomir和Antagomir以及Control Agomir转染至MDBK细胞中,然后感染BVDV新疆分离株TC株,于感染后不同时间采用实时荧光定量PCR测定BVDV 5′UTR mRNA水平,Reed-Muench法测定BVDV的效价变化。结果表明:bta-miR-302c成熟序列中的UCGUGA能特异性结合SOCS3基因3′UTR的miRNA识别位点AGCACU;与pmiRGLO相比,转染pmiRGLO-SOCS3-MRS可极显著降低相对荧光素酶反应强度(P<0.01);与转染Control Agomir和bta-miR-302c Antagomir相比,转染bta-miR-302c Agomir极显著降低SOCS3蛋白表达和mRNA转录水平(P<0.01);与转染Control Agomir和bta-miR-302c Antagomir相比,BVDV感染bta-miR-302c Agomir转染的MDBK细胞12 h后其5′UTR mRNA水平和病毒效价显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)。说明bta-miR-302c靶向于SOCS3基因3′UTR的miRNA识别位点,抑制靶基因的mRNA转录并降低其蛋白表达,以及抑制BVDV的复制。

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