利用限制性酶切-组装方法构建携带双报告基因的猴1型腺病毒载体

陈娟; 邹小辉; 郭小娟; 王晓晖; 鲁茁壮

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利用限制性酶切-组装方法构建携带双报告基因的猴1型腺病毒载体

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限制性酶切-组装是构建和改造腺病毒载体的一种简便方法,本研究用该方法构建同时携带GFP和萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase, Fluc)报告基因的猴1型腺病毒(Simian Adenovirus 1, SAdV-1)载体。PCR分别扩增GFP和Fluc基因,重叠延伸PCR将两个目的基因通过T2A短肽编码序列串联得到融合基因GFluc。限制性内切酶Spe I酶切腺病毒质粒pKSAV1-EG,去除原有的外源基因,将载体片段与GFluc片段进行限制性酶切-组装,产物转化大肠杆菌感受态细胞,获得腺病毒质粒pKSAV1-GFluc。通过限制性内切酶酶切分析、PCR产物测序证实质粒构建正确。pKSAV1-GFluc质粒经Swa I酶切线性化后转染SAdV-1包装细胞系293SE13,4 d后GFP+细胞形成荧光灶,并持续增大,表明重组病毒拯救成功;对重组病毒基因组进行了限制性酶切鉴定。扩增病毒并进行纯化,在细胞水平和动物模型中检测到目的蛋白GFP和Fluc的表达。本研究成功构建同时携带GFP和Fluc报告基因的SAdV-1载体,显示了限制性酶切-组装方法的易用性和可靠性,并为研究SAdV-1载体在小鼠模型的组织分布奠定基础。

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来源
《病毒学报》 |2023年第3期|791-799|共9页
作者
陈娟; 邹小辉; 郭小娟; 王晓晖; 鲁茁壮;
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作者单位

内蒙古科技大学包头医学院公共卫生学院;

包头014040;

中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所;

国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室;

北京100052;

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原文格式 PDF
正文语种 chi
中图分类其他病毒;
关键词
报告基因; 限制性酶切-组装; 猴1型腺病毒; 载体;

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