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KSR2基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建及其与hcmv-miR-UL70-3p和hcmv-miR-US4-3p靶向关系验证

         
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人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)的miR-UL70-3p和miR-US4-3p是HCMV microRNA(miRNA)家族中的一员,前期经生物信息学分析发现,Ras激酶抑制剂2(Kinase Suppressor 2 of Ras,KSR2)的3’-UTR区为miR-UL70-3p和miR-US4-3p的高度可疑结合靶点。为进一步鉴定miR-UL70-3p和miR-US4-3p与KSR2基因的靶标关系,本研究通过构建GV272-KSR2-3’UTR野生和突变型载体,进行双荧光素酶(Luciferase)报告基因实验,并测定其荧光值活性的方法判定miR-UL70-3p和miR-US4-3p是否能与KSR2基因结合。先将293T细胞复苏、扩增并进行质粒转染,转染分6组,每组重复做3孔,分组分别为①KSR2-3’UTR阴性载体与miRNA无关序列载体②KSR2-3’UTR阴性载体与miRNA有效序列载体③KSR2-3’UTR野生序列载体与miRNA无关序列载体④KSR2-3’UTR野生序列载体与miRNA有效序列载体⑤ KSR2-3’UTR突变序列载体与miRNA无关序列载体⑥ KSR2-3’UTR突变序列载体与miRNA有效序列载体。酶切及DNA测序结果显示GV272-KSR2-3’UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功。Luciferase检测显示:同一Luciferase质粒转染的两个组中,将miRNA-NC组Luciferase相对表达量均一化为1,即将实验组①③⑤均一化为1后,比较实验组③和④组、⑤和⑥组、④和⑥组之间的Luciferase检测结果,显示实验组④和实验组③相比,有显著性降低(P<0.05),实验组⑥和实验组⑤相比,实验组⑥和实验组④相比,差异具有统计学意义(P<0.05),说明hcmv-miR-UL70-3p和hcmv-miR-US4-3p可与KSR2-3’UTR结合,抑制KSR2表达。

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