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人凝血因子Ⅴ的纯化

         
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目的分离纯化人血浆中凝血因子Ⅴ(FⅤ),为研制FⅤ单克隆抗体提供抗原。方法在1 L新鲜冰冻血浆中加入酶抑制剂Benzamidine hydrochloride、二异丙基氟磷酸(DFP)和胰蛋白酶抑制剂,使其终浓度分别达到2mmol/L、1 mmol/L和50 mg/L;采用柠檬酸钡吸附、聚乙二醇6000分级沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换层析和Sephacryl-S300凝胶过滤层析,对血浆中FⅤ进行分离纯化;采用凝血测定一期法检测FⅤ活性;采用紫外分光光度法测定纯化FⅤ的蛋白含量;采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察FⅤ的纯化情况。结果经过对血浆前处理和两步层析后,FⅤ活性回收率为(11.21±3.54)%,比活性为(30.46±0.31)U/mg,浓缩倍数为(2 538.33±25.83)倍(n=3);SDS-PAGE图谱显示:原料血浆添加DFP的离子交换层析样品较之未加DFP的样品在330 kD处有更粗更清晰的蛋白条带,最终纯化的FⅤ样品仅在330 kD附近有1条较深的蛋白条带。结论本FⅤ纯化方法能够较有效地浓缩血浆中的FⅤ。

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