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首页> 中文期刊> 《岭南心血管病杂志》 >自发性高血压大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活电压依赖性钾离子通道的研究

自发性高血压大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活电压依赖性钾离子通道的研究

         
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目的冠状动脉壁张力升高和冠脉循环阻力上升是诱发心绞痛的重要因素。造成冠脉张力上升的因素有多种,其中血压升高是重要因素之一。升高的血压施加于管壁,使血管平滑肌张力上升,机体通过复杂的自适应机制,启动血管舒张机制,以平衡和维持冠状动脉循环的动态平衡。目前,高血压背景下冠状动脉的适应性舒张机制尚未明确。本研究选取自发性高血压大鼠(SHR)为高血压模型,应用电生理膜片钳技术和分子生物学手段,研究高血压大鼠冠状动脉平滑肌细胞(CASMCs)大电导钙激活电压依赖性钾离子通道(BK),以及BK通道的表达,并与正常血压组对照,阐明高血压大鼠CASMCs复极电流是否发生适应性增加,并探讨舒张机制在维持冠脉循环中的重要地位。方法 (1)采用"三步"酶消化法,即含0.125%牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)缓冲液室温孵育10分钟,酶液Ⅰ消化10-20分钟,酶液Ⅱ消化10-15分钟。(2)分离大鼠冠状动脉平滑肌细胞后,应用膜片钳全细胞记录模式记录高血压和正常SD大鼠冠状动脉平滑肌细胞钾电流,分析大鼠CASMCs上主要的钾流成分及一般特性。(3)记录并比较SHR和WKY大鼠CASMCs上BK电流以及BK尾电流的大小。(4)提取SHR和WKY大鼠冠状动脉平滑肌细胞的RNA,并进行逆转录,利用相对定量和半定量的方法比较高血压大鼠和正常大鼠的BK通道α和β1亚基的mRNA水平。(5)提取并纯化SHR和WKY大鼠的冠状动脉平滑肌膜蛋白,采用免疫组化和westernblot方法对高血压大鼠和正常血压大鼠BK通道α和β1亚基的蛋白水平进行比较。结果 (1)电生理结果:①WKY大鼠(n=82)平均体重为310±13.2 g,平均尾动脉收缩压为112.39±13.17 mm Hg,SHR(n=61)平均体重270±15.5 g,平均尾动脉收缩压为172.057±20.13 mmHg。SHR大鼠和WKY大鼠的平均静息电位大小分别为-31.7±4.53mV(n=6)和-49.8±5.11 mV(n=6,P0.05);④在0nM IBTX时,SHR大鼠(n=6)冠脉平滑肌细胞电流密度如前述,在加入100nM IBTX后相同刺激程序记录结果相应为(pA/pF)59.46±8.17,38.19±5.79,29.94±4.46,19.92±1.41,平均下降百分比为72.6%、76.8%、76.8%、78.6%,相比较有显著性差异(PBKα>BKβ1。应用2^(-△△Ct)的计算方法,得出SHR大鼠的BKβ1亚基的mRNA的表达是WKY大鼠的5.534±1.03倍,具有显著差异(n=4,P<0.05);而SHR大鼠的BKα亚基的mRNA的表达是WKY大鼠的1.266±0.12倍,琼脂糖凝胶电泳结果与定量PCR一致。②免疫组化的结果则提示了BKoα的表达在SHR表达略高,但和WKY比无明显差异;SHR大鼠BKβ1表达则升高。③Western-blot结果说明,SHR和WKY大鼠BKα亚基蛋白灰度值比为255.98±19.17:251.36±18.51,没有明显差异,而β1亚基在两组大鼠中表达均很低,SHR大鼠β1亚基同WKY大鼠之比为84.25±12.26:29.74±5.59,具有显著性差异(P<0.05)。可见从分子生物学角度上也获得SHR大鼠的BK通道表达高于WKY大鼠,由此反映SHR大鼠冠状动脉平滑肌BK通道结构与功能改变相一致。结论 (1)大鼠冠状动脉平滑肌细胞的钾离子通道主要由BK和Kv组成,分别对IBTX和4-AP敏感。(2)SHR大鼠的心脏冠状动脉平滑肌细胞的BK通道电流明显高于WKY大鼠。(3)SHR大鼠的心脏冠状动脉平滑肌细胞的静息电位水平高于(负值变小)WKY大鼠,更趋去极化,易引起血管收缩。(4)SHR大鼠BK通道β1亚基在转录水平上高于WKY大鼠,α亚基无统计学差异。(5)SHR大鼠BK通道β1亚基蛋白表达明显升高,α亚基蛋白表达略高,但无明显差异。研究结果表明SHR大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道蛋白表达增强和电流加大,标志平滑肌细胞舒张功能适应性增强,以平衡高血压时冠脉张力的上升,这种适应机制在维护高血压冠脉循环中起重要作用。

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