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首页> 中文期刊> 《南京农业大学学报》 >甜菜夜蛾黄素单加氧酶的原核表达及其对杀虫剂的代谢作用

甜菜夜蛾黄素单加氧酶的原核表达及其对杀虫剂的代谢作用

         
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[目的]采用原核表达技术对甜菜夜蛾的黄素单加氧酶(FMO)进行体外表达,获得具有活性的FMO酶,在此基础上开展对杀虫剂的代谢功能研究。[方法]通过将甜菜夜蛾FMO基因的开放阅读框构建到pET32a原核表达载体中,在大肠杆菌中表达目的蛋白,利用该载体的His标签使用镍柱对表达蛋白进行纯化,再通过咪唑梯度洗脱得到纯化的重组FMO酶蛋白。采用还原型辅酶Ⅱ(NADPH)法测定FMO酶的活性以及对杀虫剂的氧化活性,并用HPLC法分析FMO酶催化杀虫剂降解的能力,最后用液质联用技术鉴定代谢产物。[结果]通过原核表达技术成功得到可溶性的SeFMO2与SeFMO3酶,这2种酶对FMO的模式底物甲巯咪唑与苄达明均具有氧化活性,SeFMO2与SeFMO3对甲巯咪唑S-氧化的代谢动力学参数Km值分别为37.59与3.00μmol·L^-1,对苄达明N-氧化的Km值分别为165.98与17.71μmol·L^-1。对模式底物的S-氧化活性与N-氧化活性均是SeFMO3高于SeFMO2,2种酶的S-氧化活性均高于N-氧化活性。SeFMO2和SeFMO3对毒死蜱、硫双威以及溴虫腈具有一定的代谢活性,HPLC分析表明这2种FMO酶均能催化这3种杀虫剂的氧化降解,SeFMO2对毒死蜱、溴虫腈和硫双威的降解率依次是11.8%、11.5%和27.8%,SeFMO3对它们的降解率分别是28.8%、23.1%和30.2%,其中对硫双威的降解作用较强。对硫双威代谢产物的鉴定表明:FMO主要催化硫双威的硫醚氧化,形成硫双威的砜化合物。[结论]甜菜夜蛾黄素单加氧酶对外源物具有S-氧化活性与N-氧化活性,对某些杀虫剂具有氧化代谢能力,是昆虫的重要解毒酶系之一。

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