犬黑皮质素受体-4突变体D298N真核表达载体的构建及其在MDCK细胞中的表达

宋立先; 刘春红; 王占青; 高蓉; 徐学振

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[目的]引进犬MC4R突变点,构建突变体D298N表达载体并在MDCK细胞中获得表达。[方法]设计带突变点D298N引物,以犬MC4R基因组DNA为模板,采用普通PCR和Overlap-PCR扩增编码区,将产物克隆、酶切、测序鉴定。将测序正确的基因连接到pcDNA3.1-myc-His/A载体上,将重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D298N酶切、鉴定,将测序正确的重组体转染到MDCK细胞中,继续培养3 d,提取细胞总RNA,并采用RT-PCR方法检测基因表达。提取细胞总蛋白,Western Blot鉴定蛋白表达。[结果]构建带D298N突变点的真核表达载体,提取质粒后有2处碱基不同,分别是777位碱基T→C,892位碱基G→A(引入的突变位点)。转染到MDCK后,RT-PCR和Western Blot均检测到重组体在基因水平和蛋白水平的表达。[结论]成功构建犬的重组体真核表达载体并在MDCK细胞中表达。

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来源
《安徽农业科学》 |2022年第20期|76-80|共5页
作者
宋立先; 刘春红; 王占青; 高蓉; 徐学振;
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作者单位

滨州医学院烟台附院;

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原文格式 PDF
正文语种 chi
中图分类基因载体;
关键词
犬; 黑皮质素受体-4; 真核表达载体; 定点诱变; D298N; MDCK细胞;

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